黄军霞，李 颖，钭建波，涂应锋
(1.浙江省衢州市开化县人民医院内科，浙江衢州 324300；2.哈尔滨医科大学附属第四临床医院心内科，黑龙江哈尔滨 150001)
·论 着·
低表达miRNA-21对人肺癌H358细胞增殖及凋亡作用的研究*
黄军霞1，李 颖1，钭建波1，涂应锋2△
(1.浙江省衢州市开化县人民医院内科，浙江衢州 324300；2.哈尔滨医科大学附属第四临床医院心内科，黑龙江哈尔滨 150001)
目的 探讨微RNA(miRNA)-21对人肺癌H358细胞体外增殖及诱导凋亡方面的作用。方法 采用体外转染法将miRNA-21抑制剂瞬时转染H358细胞48 h后，应用定量real-time PCR特异探针法检测H358细胞中miRNA-21的表达水平，应用MTT法检测H358细胞的生长情况，荧光缺口末端标记法(TUNEL)法分析H358细胞凋亡情况，并用Western blot检测H358细胞中抑癌基因PTEN表达的变化。结果 与对照组比较，miRNA-21 抑制剂转染组H358细胞的miRNA-21表达水平显着降低(P<0.05)，细胞生长明显受到抑制(P<0.05)，且通过PTEN靶蛋白诱导细胞凋亡(P<0.05)。结论 低表达miRNA-21可以抑制人肺癌H358细胞的体外增殖，诱导细胞凋亡，为肺癌生物治疗提供新的治疗靶点。
肺肿瘤；微RNA；PTEN；细胞凋亡
微RNA(microRNAs，miRNA)是近年来发现的一类长度为19～25个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶目标基因3′非翻译区的完全或不完全配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动[1]。实验证据表明，如同癌基因或抑癌基因的功能，miRNA可通过调控其靶基因参与的信号转导通路，影响肿瘤的发生和发展[2-3]。已证明，miRNA能够调控多种生理学和病理学的过程，如细胞分化，细胞增殖和肿瘤形成。某些miRNAs可直接参与人类肿瘤(如肺癌、乳腺癌、颅脑肿瘤、肝癌、结直肠癌及淋巴瘤等)的形成[4]。miRNA既可作为癌基因又可作为抑癌基因，参与人类肿瘤形成的多条信号通路。因此，miRNA可能作为肿瘤预防和治疗的有效应用方法[5]。miRNA-21是新近报道的一种miRNA分子，可以有效抑制乳腺癌、肝癌和胃癌等多种肿瘤的生长和转移[4,6]。然而，miRNA-21是否在肺癌生长中发挥作用研究报道极少，且其作用的分子机制目前尚不明确。因此，本研究旨在观察miRNA-21对人肺癌H358细胞体外生长的影响，以了解miRNA-21在肺癌生长中的可能作用及其机制，为miRNA在肺癌临床生物治疗方面提供新的思路和方向。
1 材料与方法
1.1 材料 主要实验试剂：miRNA-21抑制剂和抑制剂杂序由上海吉玛生物工程公司合成；转染试剂lipofectamine 2000和MTT试剂盒购自Roche公司；SYBR Green PCR Master Mix染料荧光定量real-time PCR试剂盒购自美国Applied Biosystems公司；细胞培养液RPMI 1640购自GibcoBRL公司；双抗(氨卞青霉素钠、硫酸链霉素)购自友康基业生物科技(北京)有限公司；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)购自Gibco公司；抗PTEN抗体购自Cell Signaling Technology公司。实验仪器：蛋白电泳仪、PVDF膜购于BIO-RAD公司；紫外分光光度仪(SmartSpecTM3000)购于美国BIO-RAD公司；Odyssey红外荧光扫描成像系统购于美国LI-COR公司；6孔板和96孔板购自上海拜力生物科技有限公司公司；共聚焦显微镜FV300购自日本 Olympus公司。miRNA-21引物序列上游：5′-GGG GTA GCT TAT CAG ACT G-3′，下游：5′-TGG AGT CGG CAA TTG CAC TG-3′；内参U6引物序列上游：5′-GCT TCG GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 H358细胞培养 人肺癌H358细胞，购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。用含10%胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的RPMI1640细胞培养液，于37 ℃、5%CO2条件下培养人肺癌H358细胞，待单层细胞生长达到90%融合时，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，PBS冲洗1次后备用。细胞实验分组：转染试剂对照组、miRNA-21 抑制剂转染组和miRNA-21抑制剂杂序转染组。分别转染48 h后，用于后续的实验。
1.2.2 H358细胞转染 收集处于对数生长期的人肺癌H358细胞，PBS冲洗1次，将5×104个细胞重悬于1 mL RPMI1640培养液中，转移至6孔板，在37 ℃、5%CO2条件下培养。细胞培养12 h后，将2 μL转染试剂lipofectamine 2000与5 nmol miRNA-21抑制剂和miRNA-21抑制剂杂序以体积比1∶50混合，室温放置10 min后，缓慢加入培养上清液中，摇晃混匀后继续培养。
1.2.3 MTT实验 收集各组H358细胞，以3×103个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔培养液总量200 μL，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养48 h，加入2 μg/mL的MTT液(50 μL/孔)，继续培养3 h。吸出孔内培养液后，加入DMSO液(150 μL/孔)，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。使用酶标仪检测各孔吸光度(D)值(波长570 nm)。
1.2.4 缺口末端标记法(TUNEL)法检测细胞凋亡 首先将H358细胞爬片，爬满细胞的载玻片用PBS洗涤1次，冲洗时动作需轻柔。室温下晾干载玻片，使细胞贴得更牢。4%多聚甲醛固定细胞30 min。PBS冲洗2次，每次5 min。4 mL 3%H2O2加36 mL甲醇配制的封闭液封闭细胞10 min。PBS洗2次，每次5 min。加入含0.1% Triton X-100和0.1%柠檬酸三钠的穿透液，冰上孵育2 min。使用Roche原位细胞死亡检测试剂盒(In situ cell death detection kit)进行TUNEL染色，检测细胞凋亡。根据Roche说明书制备TUNEL反应混合液，每张载玻片加50 μL TUNEL反应混合液于玻片上，放入避光湿盒中，于37 ℃孵箱中反应1 h。PBS洗2次，每次5 min。37 ℃培养箱DAPI孵育10 min，细胞核呈现蓝染。
1.2.5 细胞中RNA的提取、逆转录以及实时定量PCR分析miRNA-21的表达 首先是用1 mL Trizol吹打溶解贴壁的细胞，并将含有细胞的Trizol液收集在进口的1.5 mL EP中。每支EP管中再加入0.2 mL氯仿进行萃取，剧烈摇荡EP管15 s，经4 ℃ 13 500 r/min离心15 min。取少量上层水相液体置于新的进口离心管中，每支管中加入0.5 mL异丙醇，混匀后室温放置10 min，再经4 ℃ 13 500 r/min离心10 min，此时形成RNA沉淀。将混合液体轻轻倒出，再用1 mL的75%乙醇溶液洗涤沉淀，静置后在4 ℃ 10 600 r/min离心5 min。弃去上清液，EP管于室温条件干燥5 min，再用适量的DEPC水充分溶解干燥的RNA。按照0.5 μg RNA的加样量，充分混合样品、dNTP、逆转录酶、RT buffer和ddH2O配制成20 μL反应体系，最后经AJ000程序经行逆转录，所得cDNA样品于-20 ℃冰箱中保存。经SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒进行PCR反应，反应体系为：SYBR Green Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，补充去离子水7 μL。选择U6作为内参。
1.2.6 Western blot分析PTEN蛋白的表达 将各组细胞培养瓶置于冰上，PBS洗涤细胞3次，每个培养瓶中加入适量细胞裂解液 (Ripa∶蛋白酶抑制剂=100∶1)，收集培养瓶壁上的细胞，放置冰上裂解30 min，13 500 r/min离心15 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱中保存。取1 μL样品应用BCA试剂盒测定细胞中蛋白质浓度。依次配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶，5%SDS-PAGE积层胶，每个孔道中加入等质量(80～100 μg)的样品，电泳60～90 min，溴酚蓝快迁移出分离胶时停止电泳。恒定300 mA电流，转膜时间为80 min。取出NC膜置于5%的脱脂奶粉中，在4 ℃的环境中封闭2 h。分别用一抗PTEN抗体 (1∶200)、GAPDH (1∶1 000)在4 ℃冰箱中孵育过夜。取出孵育过抗体的NC膜，用PBS-T洗涤3 次。然后用(1∶4 000)稀释的红外荧光标记二抗均匀铺展在NC膜上，避光孵育1 h后用PBS-T洗涤3次。最后将各条NC膜用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行检测，并且计算相应条带的灰度值。
2 结 果
2.1 各组细胞miRNA-21表达水平及H358细胞增殖比较 结果显示，miRNA-21抑制剂转染组miRNA-21的表达水平较转染试剂对照组和miRNA-21抑制剂杂序转染组明显降低(P<0.05)；miRNA-21对人肺癌H358细胞增殖的影响，与转染试剂对照组比较，转染miRNA-21抑制剂后人肺癌H358细胞的增殖明显下调(P<0.05)；而转染miRNA-21抑制剂杂序对人肺癌H358细胞的增殖无明显的影响，见表1。
表1 各组细胞miRNA-21表达水平及H358 细胞增殖比较
a：P<0.05，与转染试剂对照组比较。
2.2 低表达miRNA-21对人肺癌H358细胞凋亡的影响 TUNEL染色法结果显示，与转染试剂对照组细胞凋亡率(10.35±0.22)%比较，H358细胞转染miRNA-21抑制剂后，被TUNEL染色染成绿色的凋亡细胞明显增多，为(38.65±0.73)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；而miRNA-21抑制剂杂序转染组，未引起细胞凋亡数量的增加，见图1、2。
图1 各组H358细胞TUNEL染色显示图像(×200)
1：转染试剂对照组；2：miRNA-21抑制剂转染组；3：miRNA-21抑制剂杂序转染组；a：P<0.05，与对照组比较。
图2 各组H358细胞凋亡结果比较
1：转染试剂对照组；2：miRNA-21抑制剂转染组；3：miRNA-21抑制剂杂序转染组；a：P<0.05，与转染试剂对照组比较。
图3 Western blot检测人肺癌H358细胞中PTEN的表达
2.3 低表达miRNA-21对人肺癌H358细胞中PTEN表达的影响 与miRNA-21 抑制剂杂序转染组和转染试剂对照组比较，miRNA-21 抑制剂转染组可以显着促进H358细胞中PTEN的表达(P<0.05)，见图3。
3 讨 论
miRNA最早是用在肿瘤疾病的鉴别诊断中，对10种肿瘤进行了miRNA微阵列表达谱的研究，结果表明肿瘤的类型不同，其组织中的miRNA表达谱也会存在很大差异[7]。通过病毒或脂质体技术将miRNA分子包裹后转入细胞中，导致肿瘤细胞死亡，此方法常用于治疗肺癌等特殊肿瘤。这些技术是通过调控侧序列和pre-miRNA发夹的表达，激发合成内源性的miRNA，从而达到抑制靶基因的目的[8]。Cheng等[9]通过合成抗miRNA的反义寡核苷酸序列，使其高效地转染到细胞中，达到干预miRNA抑制细胞生长和促进凋亡等生理作用。
近年来的研究显示，miRNA-21在不同肿瘤中呈差异性表达，其作用类似于癌基因，在肿瘤发生、发展过程中起关键的调控作用[10-11]。研究证明miRNA-2l通过抑制前凋亡基因，而起到致癌基因的作用。有学者推测，抑制miRNA-21的表达是否能够抑制肿瘤的生长。Li等[12]发现，过表达的miRNA-21使肿瘤细胞对某些抗肿瘤药物的敏感性降低，有促进肿瘤生长的作用。此外，临床相关的研究还表明，肿瘤组织中如果miRNA-21高表达则提示肿瘤预后较差，并且化疗的效果也不佳[13]。
目前针对miRNA-21靶分子的研究证明，miRNA-21的明确靶点有 PTEN、PDCD4、Maspin、TPM1等[14]。在本研究中，采用体外转染后MTT法检测发现，敲除H358肺癌细胞中miRNA-21的表达，可以抑制H358肺癌细胞的体外生长；TUNEL实验进一步证实，通过敲除H358肺癌细胞miRNA-21的表达可以诱导其凋亡。此外，Yan等[15]通过检测113例乳腺癌标本后发现miRNA-21在乳腺癌中表达上调，通过进一步研究还发现miRNA-21在乳腺癌中的高表达与这些患者的预后密切相关，并且miRNA-21对预后的影响与疾病阶段相对独立；该学者还发现，在乳腺癌中抑制miRNA-21可以诱导凋亡，并且下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，提示miRNA-21可以作为乳腺癌的一个治疗靶点。
肿瘤抑制因子PTEN是miRNA-21的一个重要靶点，并且增加miRNA-21的表达会导致肿瘤细胞中PTEN的表达下调，会促进肿瘤的生长。Zhu等[16]证明miRNA-21可以通过下调肿瘤抑制基因TPM1以及促凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时还可以调控PTEN和PDCD4的表达，促进细胞增殖，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。本研究同样证实通过敲除H358肺癌细胞中miRNA-21的表达，肿瘤抑制因子PTEN表达明显的升高，诱导细胞凋亡。然而，miRNA-21参与调控肺癌发生发展的调控机制还有待进一步的研究。
总而言之，通过本研究证实，低表达miRNA-21可以抑制人肺癌H358细胞的体外生长，这可能与其促进肺癌细胞PTEN的表达及诱导细胞凋亡有关。在后续研究中，本课题组将进一步探讨miRNA-21在肺癌细胞增殖作用中的分子机制，为肺癌发生发展机制的研究以及临床肺癌分子生物治疗提供一种全新的分子靶点。
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Study on effects of low expression of miRNA-21 on proliferation and apoptosis of human lung cancer H358 cell*
HuangJunxia1,LiYing1,DouJianbo1,TuYingfeng2△
(1.DepartmentofInternalMedicine,KaihuaCountyPeople′sHospital,Quzhou,Zhejiang324300,China;2.DepartmentofCardiology,FourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150001,China)
Objective To study the effects of microRNA-21 on the proliferation and apoptosis of human lung cancer cell line H358.Methods MiRNA-21 inhibitor was transiently transferred into human lung cancer cell line H358 by using transfection in vitro.The expression level of miRNA-21 in H358 cells was detected by real-time PCR before or after transfection.The MTT assay was used to assess the proliferation of H358 cells.And the cell apoptosis was analyzed by TUNEL Apoptosis Assay Kit.Furthermore,the expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) was determined by the Western-blot assay.Results The expression of miRNA-21 was markedly decreased compared with the control group (P<0.05).The proliferation of miRNA-21 inhibitor-tranfected H358 cells was obviously inhibited (P<0.01).And expression level of miRNA-21 in H358 cells was significantly decreased,the cell growth was significantly inhibited,moreover apoptosis was induced by PTEN target protein (P<0.05).Conclusion Low expression of miRNA-21 could inhibit the in vitro proliferation of H358 cells and induces apoptosis,which could provide a novel therapeutic target for anti-cancer biotherapy.
lung neoplasms;microRNAs;PTEN;apoptosis
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.004
国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81401457)；中国国家博士后基金面上项目(2014M561376)；黑龙江省博士后资助经费(LBH-Z14143)；黑龙江省自然科学基金留学基金(LC2015038)；黑龙江省卫生计生委面上项目(2014-385)。 作者简介：黄军霞(1978-)，主治医师，大学本科，主要从事肺癌及肺血管疾病分子机制研究。△
，Tel：13624606369；E-mail:tyfdoctor@163.com。
R563.9
A
1671-8348(2016)05-0588-04
2015-06-27
2015-09-22)
