赵林静，邓保国，杨保胜，张金盈
(1.新乡医学院基础医学院，河南新乡 453003；2.郑州大学第一附属医院心血管内科，郑州 450000)
论着·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.006
脂联素后处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用*
赵林静1,2，邓保国1，杨保胜1，张金盈2
(1.新乡医学院基础医学院，河南新乡 453003；2.郑州大学第一附属医院心血管内科，郑州 450000)
目的探讨脂联素(ADP)后处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤(MIRI)是否有保护作用。方法SD大鼠随机分为：(1)假手术组(Sham组)，冠状动脉左前降支(LAD)仅穿线不断流；(2)心肌缺血-再灌注损伤组(MIRI组)，LAD结扎30 min后再灌注120 min；(3)脂联素后处理组(ADP组)，LAD再灌注前20 min注射ADP，其余同MIRI组。检测各组血浆乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI) 和丙二醛(MDA)的水平，检测心肌超氧化物歧化酶(SOD)和MDA的水平，各组心肌HE染色并描记心电图。结果MIRI组血浆LDH(735.21±110.92)U/L、cTnI(37.96±5.97)μg/mL和MDA(4.55±0.18)nmol/L较Sham组升高 (P<0.05)，ADP组血浆LDH(579.25±69.01)U/L、cTnI(21.07±5.77)μg/mL和MDA(2.99±0.22)U/L水平较MIRI组降低(P<0.05)；与Sham组相比，MIRI组心肌SOD水平(11.47±1.67)U/mg降低而MDA水平(7.99±0.59)nmol/mg升高(P<0.05)；与MIRI组相比，ADP组心肌SOD水平(13.93±0.97)U/mg升高而MDA水平(5.74±0.64)nmol/mg降低(P<0.05)。结论ADP后处理可以减轻大鼠MIRI，可能与减少脂质过氧化和增强自由基清除有关。
脂联素;再灌注损伤；心肌；缺血后处理
随着近年静脉溶栓、经皮冠脉腔内成形术和冠脉旁路移植术等方法被广泛应用于心血管临床，急性心肌梗死的病死率有所下降，但是同时心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)包括心肌抑顿和再灌注心律失常等现象愈发引起关注，成为临床亟待解决的问题。针对MIRI，缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)被公认为是最强的心肌保护措施，但患者心肌缺血事件的发生难以预测，各种临床治疗均是在心肌缺血后实施的，所以在2003年提出的缺血后处理(ischemic postconditioning,IPO)的概念更贴近临床，成为抗MIRI的研究热点。但由于单纯IPO对机体是有损操作，临床并不可行，于是各种药物IPO得到了更多关注，其中脂联素(adiponectin，ADP)因其广泛的药理作用而备受关注。吴芹等[1]发现提高ADP水平可增强心脏IPC对大鼠MIRI 的保护作用，本组前期实验也证实ADP可以增强大鼠肢体IPC对MIRI 的保护效应[2]，但ADP后处理对大鼠MIRI是否具有保护作用还研究甚少。本实验在大鼠心肌缺血再灌注前给予ADP后处理，观察ADP后处理是否对MIRI有保护作用，以期为临床MIRI的早期干预提供实验依据。
1 材料与方法
1.1实验动物及试剂仪器清洁级SD大鼠30只，体质量220～280 g，由河南省实验动物中心提供。所有动物适应性饲养1周，实验前禁食12 h，不禁水。主要试剂：脂联素购自美国Phoenix公司，批号426002；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒，丙二醛(MDA)试剂盒和心肌肌钙蛋白I (cTnI)试剂盒均购自美国R&D公司。主要仪器：光学显微镜(上海豫光仪器公司)，Lei Ca RM 2235切片机，DHX-150B型动物呼吸机(特力麻醉呼吸设备公司)，ECG-100型心电图机(深圳邦健电子公司)，DNM-9602A型酶标分析仪(成都广普仪器公司)。
1.2实验方法
1.2.1大鼠在体MIRI模型建立大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉(每100克0.3 mL)后仰卧位固定，1%聚维酮碘颈部消毒后分离气管并穿线后剪开气管，插入气管插管连接呼吸机进行机械通气支持(潮气量15～20 mL，呼吸频率每分钟70～80次，呼吸比1.0∶1.5)，分别经四肢插入针型电极描记标Ⅱ导联心电图，按照本组前期操作[3]，建立大鼠MIRI模型。
1.2.2动物分组造模成功的大鼠随机分为以下3组，每组10只：(1)假手术(Sham)组，开胸后分离冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)后并不结扎断流；(2)MIRI组，LAD穿线后结扎断流血流30 min后松开线结再灌注120 min；(3)脂联素后处理组(ADP组)，药物后处理的时间点采用本组前期常规操作即在LAD再灌注前20 min经股静脉注射ADP(1.8 μg/g)，其余操作同MIRI组。
1.2.3标本留取和指标检测各组动物LAD缺血再灌注120 min后(Sham组LAD仅穿线后150 min)，自颈总动脉取血2～3 mL，3 500 r/min离心10 min后取上清液，分装入Eppendorf管待检。用ELISA法检测血浆LDH、SOD、MDA和cTnI含量。同时摘取大鼠心脏用生理盐水反复洗涤，剪下左心室心肌放入冻存管入液氮冻存。测定时称取心肌200 mg，剪碎后移入装有2 mL冷生理盐水的匀浆管中冰浴匀浆，3 500 r/min离心15 min后收集上清液，用ELISA法检测心肌SOD和MDA水平。最后每组取2只大鼠迅速摘取心脏，在左心室最大横径处横切并去除左心耳，经4%多聚甲醛固定后HE染色。
2 结 果
2.1各组大鼠血浆LDH、cTnI和MDA的水平MIRI组大鼠血浆LDH、cTnI和MDA水平与Sham组相比升高(P<0.05)，ADP组血浆LDH、cTnI和MDA水平较MIRI组降低(P<0.05)，见表1。
表1 各组大鼠血浆LDH、cTnI和MDA水平
a：P<0.05，与Sham组比较；b：P<0.05，与MIRI组比较
2.2各组大鼠心肌SOD和MDA水平与Sham组相比，MIRI组心肌SOD水平降低而MDA水平升高 (P<0.05)；与MIRI组相比，ADP组心肌SOD水平升高而MDA水平降低(P<0.05)，见表2。
表2 各组大鼠心肌中SOD和MDA水平
a：P<0.05，与Sham组比较；b：P<0.05，与MIRI组比较
2.3各组大鼠心肌形态学结果各组大鼠心脏标本HE染色后，光镜下可见：Sham组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌横纹清晰，心内膜内皮完整；MIRI组大鼠部分心肌纤维出现溶解和断裂，肌间质间隙扩大，横纹不清晰，心内膜内皮不完整；ADP组和MIRI组相比大鼠心肌的病理损伤有所减轻。见图1～3。
图1 Sham组心肌HE染色(×400)
图2 MIRI组心肌HE染色(×400)
图3 ADP组心肌HE染色(×400)
2.4各组大鼠标Ⅱ导联心电图结果Sham组大鼠心电图结果正常，MIRI组大鼠心电图呈明显急性缺血性改变，ADP组和MIRI组相比心电图急性缺血性改变明显减轻。结果见图4～6。
图4 Sham组标Ⅱ导联心电图
图5 MIRI组标Ⅱ导联心电图
图6 ADP组标Ⅱ导联心电图
3 讨 论
大鼠心血管解剖结构包括冠状动脉支配区，与人体非常相似，MIRI的发生率较高，因此大鼠是MIRI理想的研究对象[4]。本实验选用8周龄以上大鼠，体质量超过220 g，处于性成熟期的成年阶段，对各种损伤抵抗力相对较强。
ADP是由脂肪细胞分泌的一种血浆细胞因子性蛋白质。研究发现，高血压和冠心病等患者ADP水平明显降低，提示ADP具有心脏保护作用[5]。在动物实验中有更多关于ADP心脏保护的报道，有学者报道大鼠MIRI越严重，ADP水平下降越明显，当使用ADP基因敲除大鼠制作MIRI模型，可见心肌梗死范围明显扩大，当采用腺病毒介导ADP 转染则可减少梗死面积[6]。
LDH及cTnI正常主要存在于心肌和骨骼肌中，血中含量很低。当心肌损伤和大量细胞死亡时逸出入血，且二者升高水平与心肌损伤程度大致平行[7]。cTnI是心肌众多调节蛋白中的重要成分，作为新的心肌损伤评价指标近年广受重视。因为cTnI相对分子质量较小仅为22 500，心肌受损初期即可入血并在血中持续时间长，所以敏感性强，被称为检测心肌受损程度的“金标准”[8]。本实验中MIRI组血清LDH和cTnI含量比Sham组明显升高，提示存在MIRI;ADP组血清LDH和cTnI含量较MIRI组降低，提示ADP后处理对MIRI有保护作用。
氧自由基化学性质活泼，能对生物大分子如DNA碱基、蛋白质和脂质等造成过氧化损伤形成氧化应激状态，通过损伤DNA碱基，产生蛋白氧化产物及脂质过氧化等导致组织损伤，参与了多种疾病的发生发展[9]。心肌缺血再灌注产生的氧自由基能攻击生物膜，引发脂质过氧化，最终导致细胞损伤。心肌缺血再灌注过程中，通过白细胞“呼吸暴发”等途径自由基的产生急剧增多[10]。
MDA化学性质十分稳定，是自由基攻击膜性成分多不饱和脂肪酸的终产物，组织MDA水平是反映自由基损伤程度的重要指标[11]。SOD是体内主要的酶性自由基清除剂，清除过程中SOD被大量消耗，所以MDA和SOD水平可反映机体脂质过氧化损伤程度。本试验中MIRI组血清心肌酶含量增高，同时血浆和心肌中MDA水平升高而心肌SOD水平下降，提示心肌的脂质过氧化可能参与了MIRI，推测SOD水平降低与在清除自由基过程中被大量消耗有关。
目前发现，ADP也有抗氧化应激的作用，能减少活性氧产生并改善内皮功能[12]；通过细胞培养和临床实验都证实了ADP可以改善细胞氧化应激状况[13-14]。有学者通过ADP对人心肌细胞氧化应激的干预指出，ADP可以通过降低衔接蛋白P66shc mRNA表达，使磷酸化的p66shc表达减少，降低人心肌细胞的氧化应激水平[15]。此外袁芳等[16]也通过动物实验证实ADP能通过刺激腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化而抑制活性氧产生和减少MDA的生成，从而减缓氧化应激反应。
在临床实验中也提示ADP和氧化应激也有关系[13]。林书坡等[3]通过临床病例分析指出，ADP与冠状动脉粥样硬化过程中的脂质代谢异常及氧化应激密切相关，ADP和机体氧化应激状态可能在冠心病包括急性心梗的发病中起重要作用。本实验中ADP组血浆和心肌MDA含量下降而心肌SOD含量升高，提示减少脂质过氧化和加强自由基清除可能参与了ADP后处理对MIRI的保护；MIRI组血清心肌酶含量增高，同时血浆和心肌MDA含量升高而心肌SOD含量下降，提示心肌的脂质过氧化参与了MIRI。
通过脂联素等药物IPO对大鼠MIRI的研究，提示是否临床可以对急性心梗患者采取类似的药物后处理来保护缺血心肌。综上所述，本实验从药物后处理的角度对MIRI的防治进行了探讨，提示ADP缺血后处理对大鼠MIRI具有保护作用，可能与增强自由基清除和减少脂质过氧化反应相关，但深入机制还有待于进一步研究。
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The role of adiponectin postconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in rats*
Zhao Linjing1,2,Deng Baoguo1,Yang Baosheng1,Zhang Jinying2
(1.SchoolofBasicMedical,XinxaingMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003,China;2.DepartmentofVasculocardiology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China)
ObjectiveTo study the role of adiponectin (ADP) postconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI) in rats.MethodsSD rats were divided randomly into 3 groups：⑴Group Sham were processed identically except the left anterior descending coronary artery(LAD) and was not ligated;⑵Group MIRI were subjected to LAD occlusion for 30 min and reperfusion for 120 min;⑶Group ADP were subjected to ADP injection before reperfusion.The titer of lactate dehydrogenase(LDH),cardiac troponin I(cTnI) and malondialdehyde(MDA)in plasma were observed.The levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in myocardial tissue were observed.The results of HE staining and electrocardiograms(ECG) was observed.ResultsCompared with Group Sham,LDH,cTnI and MDA in plasma in Group MIRI increased (P<0.05);Compared with Group MIRI,LDH,cTnI and MDA in plasma in Group ADP declined (P<0.05);Compared with Group Sham,SOD decreased and MDA increased in myocardial tissue in Group MIRI (P<0.05);Compared with Group MIRI,SOD increased and MDA decreased in myocardial tissue in Group ADP (P<0.05).The myocardial injury was serious in Group MIRI while it was lightened in Group ADP.There were acute ischemia ECG change in Group MIRI while it was slight in Group ADP.ConclusionADP postconditioning is a protective factor against MIRI in rats,it is related to eliminating free radicals and alleviating the damage of lipid peroxidation.
adiponectin;reperfusion injury;myocardium;ischemic postconditioning
河南省科技厅科技发展计划基金资助(411045800)。作者简介：赵林静(1970-)，讲师，在读博士，主要从事心脏缺血再灌注损伤防治的研究。
R363.2
A
1671-8348(2016)27-3763-03
2016-02-11
2016-04-06)
