王 雷，杜媛鲲，米 源，廖海江，王 林
(1.河北医科大学第四医院胸二科，石家庄 050011;2.河北医科大学期刊社，石家庄 050017)
论着·基础研究
Gli抑制剂诱导胃癌细胞凋亡作用的研究
王 雷1，杜媛鲲2，米 源1，廖海江1，王 林1
(1.河北医科大学第四医院胸二科，石家庄 050011;2.河北医科大学期刊社，石家庄 050017)
目的 研究Gli抑制剂GANT61对人胃癌细胞AZ521和AGS凋亡的作用。方法 应用不同浓度(0、10、20μmol/L)的GANT61处理AZ521和AGS 细胞24h后，蛋白免疫印迹法(Western blot)观察GANT61作用于AZ521和AGS细胞后对Gli-1、Gli-2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响。流式细胞术观察细胞凋亡及Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。结果 Western blot 结果显示GANT61可以剂量依赖性显着下调AZ521和AGS细胞Gli-1、Gli-2和Bcl-2蛋白表达和增加Caspase-3蛋白表达。流式细胞术检测显示10μmol/L GANT61作用AZ521，AGS细胞后凋亡率为(19.37±0.81)%和(16.1±0.26)%，显着高于0μmol/L GANT61凋亡率(4.23±0.35)%和(6.00±0.87)%(P<0.05)； 10μmol/L和20μmol/L GAN761的AZ521细胞中Bcl-2蛋白表达水平分别为355.33±10.12、312.67±7.37，与0μmol/L GANT61423.33±11.37相比显着降低(P<0.05) ；10μmol/L和20μmol/L GAN761的AGS细胞中Bcl-2蛋白表达水平分别为306.67±4.16、273.33±8.02，与0μmol/L GANT61388.33±11.06相比显着降低(P<0.05) ； 10μmol/L和20μmol/L GANT61的AZ521细胞中Caspase-3蛋白表达水平分别为305±9.64、360.24±8.54，与0μmol/L GANT61261.12±11.53相比显着增高(P<0.05)；10μmol/L和 20μmol/L GANT61的AGS细胞中Caspase-3蛋白表达水平分别为255.00±6.56、310.67±8.50，与0μmol/L GANT61198.33±2.50相比显着增高(P<0.05)。结论 GANT61通过特异性抑制Gli-1，Gli-2蛋白表达从而调节AZ521和AGS细胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平，诱导细胞凋亡。
胃肿瘤；细胞凋亡；GANT61；Gli-1；Gli-2
虽然近几十年胃癌的发病率和致死率在逐年降低，但其仍然是全世界范围内排名第4的常见恶性肿瘤，也是与肿瘤相关的第2位致死原因[1]。即使人们已经大量研究了胃癌的分子学机制，但是现有的治疗措施并没有明显改善复发和转移的胃癌患者的预后，如何深入探索胃癌的分子机制及找出更好治疗的靶点是当前的研究热点。研究表明，Hh信号传导通路在多种人类肿瘤中发挥关键作用，在非小细胞肺癌、基底细胞癌、甲状腺乳头状癌和肝细胞癌和乳腺癌等多种肿瘤中与肿瘤细胞的生长增殖、血管生成和转移密切相关，针对Hh通路的靶向治疗可以抑制肿瘤细胞的增殖和转移[2-8]。本研究通过应用Hh通路抑制剂GANT61特异性下调人胃癌细胞系AZ521和AGS中的Gli的表达，探讨GANT61对胃癌细胞凋亡的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人胃腺癌细胞系AZ521和AGS购自英国Sigma-Aldrich公司，EMEM培养液(美国Gibco公司)，Ham培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gemini公司)，DMSO (美国MPBIO 公司)，GANT61(美国Selleckchem公司)，M-PER培养细胞总蛋白提取试剂(美国Thermo Scientific公司)，Pierce-BCA 蛋白分析试剂盒(美国Thermo Scientific公司) Gli-1兔抗人多克隆抗体(ab49314，美国Abcam公司)，Gli-2鼠抗人单克隆抗体(sc-271786，美国Santa Cruze公司)，Bcl-2鼠抗人单克隆抗体(sc-7480，美国Santa Cruze公司)，cleaved Caspase-3兔抗人单克隆抗体(#9664S，美国cell signaling公司),GAPDH鼠抗人单克隆抗体(美国 Santa Cruz公司)，超敏 ECL 化学发光试剂盒(美国Thermo Scientific公司)，Epics-XL 型流式细胞仪(美国 Beckman Coulter公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 胃癌细胞系AZ521于含10%胎牛血清和青-链霉素各100mg/mL的EMEM培养基培养；AGS细胞于含10%胎牛血清和青-链霉素各100mg/mL的Ham培养基培养。分别取对数生长期的AZ521和AGS细胞接种至6孔板，采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测，接种至25cm2培养瓶中供流式细胞术实验。
1.2.2 Western blot检测蛋白表达 细胞于6孔板内贴壁生长良好后更换为含2%胎牛血清的培养基，分别加入终浓度为10、20μmol/L的GANT61处理AZ521、AGS细胞24h，并设置DMSO对照(0μmol/L GANT61)。采用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞后加含有蛋白酶抑制剂的M-PER细胞总蛋白提取试剂， BCA 法测定各组细胞总蛋白浓度。常规Western blot 方法检测Gli-1、Gli-2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达，一抗Gli-1的工作浓度为1∶1000；一抗Gli-2的工作浓度为1∶250；一抗Bcl-2的工作浓度为1∶ 250；一抗Caspase-3的工作浓度为1∶1000；一抗 GAPDH的工作浓度为1∶10000，二抗的工作浓度均为1∶20000。ECL 试剂发光，暗室显影，每组实验重复3次。
1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞于25cm2培养瓶内贴壁生长良好后更换为含2%胎牛血清的培养基，加入终浓度为10μmol/L的GANT61作用AZ521、AGS细胞24h，设DMSO对照(0μmol/L GANT61)。PBS洗涤，胰酶消化，离心收集细胞，70%乙醇固定细胞制备成单细胞悬液，加入50μg/mL PI染液4℃染色，流式细胞仪检测荧光强度和应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，以亚二倍体峰代表细胞凋亡峰计算细胞凋亡率。
1.2.4 流式细胞术检测肿瘤细胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表达量 细胞于25cm2培养瓶内贴壁生长良好后更换为含2%胎牛血清的培养基，分别加入终浓度为10、20μmol/L的GANT61作用AZ521、AGS细胞24h，设DMSO对照(0μmol/L GANT61)。PBS洗涤，胰酶消化，离心收集细胞，70%乙醇固定细胞用于流式细胞术检测。调整每份样品的细胞数为1×106/0.1mL，分别加入鼠抗人Bcl-2及兔抗人Caspase-3抗体，常温放置30min后用PBS洗涤2次，再分别加入1∶50稀释的羊抗小鼠和羊抗兔FITC标记的IgG二抗，常温放置30min后用PBS洗涤2次，流式细胞仪检测蛋白含量，蛋白量以平均荧光强度表示，每组实验重复3次。
2 结 果
2.1 Western blot检测蛋白表达 与0μmol/L GANT61比较，GANT61可以下调AZ521和AGS细胞Gli-1、Gli-2和Bcl-2蛋白表达，增加Caspase-3蛋白表达，且具有剂量依赖性，见图1、2。
1:0μmol/L GANT61；2:10μmol/L GANT61;3:20μmol/L GANT61
1:0μmol/L GANT61；2:10μmol/L GANT61;3:20μmol/L GANT61
表1 流式细胞术检测不同浓度GANT61作用AZ521细胞24h细胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平
表2 流式细胞术检测不同浓度GANT61作用AGS细胞24h细胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平
2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率 10μmol/L GANT61作用AZ521细胞24h后细胞凋亡率为(19.37±0.81)%，与0μmol/L GANT61凋亡率(4.23±0.35)%相比显着增高(P<0.05)；10μmol/L GANT61作用AGS细胞24h后细胞凋亡率为(16.1±0.26)%，与0μmol/L GANT61凋亡率(6.00±0.87)%相比显着增高(P<0.05)。
2.3 流式细胞术检测细胞凋亡结果 与0μmol/L GANT61比较， GANT61处理AZ521细胞24h后细胞中Bcl-2蛋白表达降低，且具有剂量依赖性(P<0.05)；Caspase-3蛋白表达升高且具有剂量依赖性(P<0.05)，见表1；与0μmol/L GANT61相比， GANT61处理AGS细胞24h后细胞中Bcl-2蛋白表达降低，且具有剂量依赖性(P<0.05)；Caspase-3蛋白表达升高且具有剂量依赖性(P<0.05)，见表2。
3 讨 论
一些信号传导通路的异常激活在肿瘤的发病机制起着重要的作用。目前，发现Hh信号传导通路与人类绝大多数肿瘤的发生、发展过程密切相关。经典的Hh 通路活化途径由Hh-Ptch-SMO-Gli 轴组成，当过表达的Hh与受体Ptch相结合时可以解除Ptch对SMO的抑制作用，导致SMO激活核转录因子Gli从而调控下游靶基因的转录。Gli-1和Gli-2作为该通路的核心成员发挥着通路调节器的作用，在细胞的自我更新，细胞周期和凋亡起着重要作用[9-10]。同时，研究发现Gli在胃癌组织中高表达且和预后相关[11]，因此，本研究针对Gli靶点进行抗肿瘤研究。GANT61是近年来研发的针对Gli靶点的特异性抑制剂之一，具有抑制肿瘤生长和侵袭，抗增殖和诱导细胞凋亡等作用，表现出显着的抗肿瘤活性[12-13]，本实验通过探索GANT61对胃癌细胞凋亡的影响及其可能的相关机制，为临床上研究GANT61抗胃癌机制提供实验基础。
研究表明肿瘤细胞的凋亡是由多基因精确调控的过程，凋亡调控紊乱可以导致肿瘤的发生，因此，探寻诱导肿瘤细胞凋亡的药物也为抗肿瘤研究开辟了新途径。Srivastava等[14]研究发现GANT61可以下调横纹肌肉瘤细胞的Gli-1和Gli-2蛋白表达，上调Caspase-3表达从而达到抗肿瘤细胞增殖和促进凋亡的效果。本研究显示，应用GANT61处理胃癌细胞24h后凋亡率较DMSO组显着增高，提示GANT61可以通过诱导细胞凋亡达到抗肿瘤作用。因为凋亡抑制基因Bcl-2与人类肿瘤的发生密切相关，它可以通过抑制多条凋亡信号进而影响细胞凋亡，并且有研究表明Bcl-2可能是Gli-1和Gli-2直接的转录靶基因[15]；而Caspase-3作为最具代表性的凋亡执行因子，可以作用于特异性底物从而使细胞发生一系列生化及形态学改变，最终导致凋亡的发生，所以，笔者接下来通过蛋白印迹和流式细胞术等方法观察了GANT61对胃癌细胞Gli，Bcl-2和Caspase-3等蛋白的影响，初步探讨GANT61诱导胃癌细胞凋亡的机制，结果发现GANT61可呈剂量依赖性显着抑制AZ521和AGS 细胞的Gli-1，Gli-2和Bcl-2蛋白表达，上调Caspase-3蛋白表达。分析其原因可能是Hh 信号通路Gli在胃癌中处于活化状态并参与了肿瘤细胞的凋亡过程，GANT61可通过特异性抑制Gli来调控凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3表达，实现对AZ521和AGS细胞的生长抑制作用。
综上所述，GANT61可以通过诱导AZ521和AGS细胞凋亡从而达到抗胃癌的作用，针对Gli的靶向治疗具有广泛的应用前景，本研究为胃癌的临床治疗开辟了一个新途径。
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Inhibition of gastric cancer cell by Gli inhibitor through induction of cell apoptosis
Wang Lei1,Du Yuankun2，Mi Yuan1，Liao Haijiang1,WangLin1
(1.Second Department of Thoracic Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiangzhuang,Hebei 050011,China；2.Hebei Medical University Journal Association，Shijiangzhuang，Hebei 050017,China)
Objective To research the apoptosis-inducing function of Gli inhibitor on the human gastric carcinoma cells AZ521,AGS．Methods After adding different concentrations (0,10,20μmol/L)of GANT61for 24h,the protein expression of Gli-1，Gli-2，Bcl-2and Caspase-3were detected by Western blot in AZ521and AGS cell lines．Cell apoptosis，Bcl-2and Caspase-3expression level of AZ521and AGS after the different concentrations treatment of GANT61were detected by flow cytometry.Results Western blot assay showed that GANT61decreased Gli-1,Gli-2，Bcl-2protein expression and increased Caspase-3protein expression by dose-dependent manner.Cell apoptosis rate of AZ521and AGS cells were (19.37±0.81)%,(16.1±0.26)%,which were significantly higher than those of 0μmol/L GANT61(4.23±0.35)% and (6.00±0.87)% (P<0.05).The Bcl-2protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AZ521cells were 355.33±10.12,312.67±7.37，which were significantly lower than 0μmol/L GANT61423.33±11.37(P<0.05)． The Bcl-2protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AGS cell were 306.67±4.16，273.33±8.02，which were significantly lower than 0μmol/L GANT61(388.33±11.06) (P<0.05)．The Caspase-3protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AZ521cells were 305.00±9.64,360.24±8.54,which were significantly higher than that 0μmol/L GANT61261.12±11.53(P<0.05)．The caspase-3protein expression level of 10μmol/L and 20μmol/L GANT61groups in AGS cell were 255.00±6.56，310.67±8.50,which were significantly higher than 0μmol/L GANT61198.33±2.50(P<0.05).Conclusion GANT61can effectively induce cell apoptosis of AZ521and AGS cells by decreasing Gli-1,Gli-2to regulate Bcl-2and Caspase-3protein expression level in gastric cancer．
gastric neoplasms；apoptosis;GANT61；Gli-1;Gli-2
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.006
王雷(1976-)，副教授，博士后，主要从事胸部肿瘤的手术和靶向治疗研究。
R734.2
A
1671-8348(2016)29-4050-03
2016-02-08
2016-04-18)
