何 培，李正伟，许益娟，张若鹏
(1.大理大学临床医学院，云南大理 671000；2.大理大学附属医院生殖医学科，云南大理 671000)
主动免疫疗法对体外受精-胚胎移植反复着床失败影响的研究*
何 培1，李正伟1，许益娟1，张若鹏2△
(1.大理大学临床医学院，云南大理 671000；2.大理大学附属医院生殖医学科，云南大理 671000)
目的 探讨临床应用主动免疫疗法治疗体外受精-胚胎移植(IVF-ET)反复着床失败患者再次行IVF-ET结局的影响。方法 在进入新的控制性卵巢刺激周期前，30对接受主动免疫治疗的患者设为试验组，64对拒绝免疫治疗的患者为对照组，观察两组患者排卵期性激素水平、移植时内膜厚度和临床妊娠率、异位妊娠率、流产率。结果 体外受精-胚胎移植反复着床失败的患者封闭抗体转阳后，试验组和对照组在新的治疗周期中子宫内膜厚度、黄体生成素、黄体酮及雌二醇，差异无统计学意义(P>0.05)。两组流产率及异位妊娠率无明显差异(P>0.05)；试验组临床妊娠率40.0%，显示高于对照组(12.5%),差异有统计学意义 (P<0.05)。结论 淋巴细胞主动免疫治疗对体外受精-胚胎移植反复着床失败的患者有一定的临床应用价值。
淋巴细胞主动免疫治疗;性激素水平;移植时内膜厚度;临床妊娠率;流产率;异位妊娠率
随着现代社会环境污染严峻，人们生活方式的改变，以及婚育年龄普遍推迟等影响，人类的正常生活受到干扰，由此引起的生理-心理-社会医学模式的不协调，不孕症的发病率呈逐年上升趋势，成为仅次于肿瘤和心血管疾病之后的第三大疾病。体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技术成为治疗不孕症的有效方法。胚胎着床是妊娠成功的起始和关键的步骤。大规模的流行病学调查，近年来IVF-ET的着床率在20%～30%[1]。不同的生殖中心对反复胚胎着床失败(repeated failure of embryo implantation，RIF)的定义并不相同，有学者建议将RIF的定义为：至少连续3个IVF-ET失败，且每周期中有一个或两个优质胚胎[2]。RIF已成为困扰临床医生和不孕患者的一个难题[3]。淋巴细胞主动免疫疗法现已广泛应用于复发性流产患者中，并已取得良好的治疗效果。基于这一理念，笔者尝试将其应用于反复着床失败的患者中，观察其治疗结局并进行分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 纳入标准：男女双方年龄25～38岁，移植优质胚胎不少于3次；既往抗梅毒螺旋体、弓形体抗体、单纯性疱疹病毒抗体、巨细胞病毒抗体、风疹病毒抗体、封闭抗体检测阴性，周期胚胎移植(ET)前日子宫内膜Salle评分大于或等于13分；夫妇双方染色体检查正常；乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒及梅毒血清学筛查阴性。排除标准：排除解剖异常、内分泌异常、生殖道感染、染色体异常、自身免疫疾病、输卵管积水和卵巢低反应性及女方有烟、酒等不良嗜好。
将2010年8月至2015年3月于大理大学附属医院生殖医学科就诊，符合上述标准的94对患者作为研究对象。该研究符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准。将淋巴细胞主动免疫治疗的利弊、费用、可能存在的风险等告知每对夫妇，30对夫妇同意试行淋巴细胞主动免疫治疗，作为试验组；另64对夫妇拒绝接受免疫治疗，为对照组。供血者选择丈夫或第三方亲属。
1.2 方法
1.2.1 丈夫淋巴细胞主动免疫治疗方法 人淋巴细胞分离液由天津市灏洋生物科技有限责任公司生产。常规消毒后，抽取供者上肢静脉血15～20 mL，用适量肝素抗凝，37 ℃水浴30 min，加入0.9%氯化钠6 mL混匀,将混匀液缓缓加入4个含有5 mL细胞分离液离心管中，每管约6 mL；1 100 r/min离心30 min，离心管中由上至下分为4层：第1层为血浆，第2层为环状乳白色淋巴细胞层，第3层为透明分离液层，第4层为红细胞层。收集淋巴细胞置于 3 mL 0.9%氯化钠中平衡，1 100 r/min离心10 min，去上清液，将淋巴细胞团置于0.9%氯化钠1 mL中混匀，标记患者姓名备用。取少许混悬液，计数淋巴细胞，调密度达(40～70)×106/mL，于女方前臂内侧等份皮内注射4～9个点，每2～4周为1次，行淋巴细胞免疫治疗。封闭抗体由昆明金域医学检验所检测，转为阳性后3～4次后再次胚胎移植，确定妊娠后再行2～4次上述治疗。
1.2.2 再次行IVF-ET 再次IVF-ET控制性卵巢刺激方案，超声引导下经阴道行卵泡穿刺法取卵，选择优质胚胎(卵裂球6～8细胞，第3天胚胎1～3枚)。选取卵后第3天后行胚胎移植，余下的胚胎养囊胚或直接胚胎冷冻保存。在第3天行胚胎移植后要给黄体酮和(或)HCG黄体支持疗法。
1.3 妊娠诊断指标 胚胎移植14 d后查血清HCG>5 U/L，或留晨尿为阳性，诊断为生化妊娠，继续用黄体支持，移植28 d后，B超下官腔内见到孕囊，诊断临床妊娠。观察内容包括：血HCG测定，尿妊娠HCG试验，超声查出孕囊位置及个数等，资料完整。 血HCG测定妊娠：诊断早期妊娠,孕后35～50 d HCG可升至2 500 U/L。60～70 d可达8×1011mU/L。血HCG定量免疫测定浓度大于25 U/L定为妊娠阳性；10～25 U/L之间可疑。尿-HCG(HCG半定量法)：非孕妇女小于25 U/L,孕40 d大于5 000 U/L,孕60～70 d大于(8～32)×104U/L(清晨尿HCG水平最高，接近血清水平)。
2 结 果
2.1 两组女方平均年龄、不孕次数比较 对照组平均年龄(29.70±3.36)岁，不孕次数(3.55±0.83)次，试验组平均年龄(29.83±2.82)岁，不孕次数(3.90±1.18)次，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 两组子宫内膜厚度、LH、P、E2 比较 试验组子宫内膜厚度、LH、P、E2略高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
体外受精-胚胎移植反复着床失败的患者封闭抗体转阳后，试验组和对照组在新的治疗周期中子宫内膜厚度、黄体生成素(LH)、黄体酮(P)及雌二醇(E2)，差异无统计学意义(P>0.05)。流产率及异位妊娠率无明显差异(P>0.05)，两组临床妊娠率相比(P<0.05),试验组较对照组有所提高。
表1 不同组别患者的子宫内膜厚度、LH、P及E2的比较
2.3 超声检查结果 根据B超检查所示，体外受精-胚胎移植反复着床失败的患者行主动免疫疗法后可成功妊娠。见图1、2。
超声提示：子宫、双附件区未见异常声像。
图1 不孕症患者未行主动免疫疗法超声检查结果
超声提示：宫内单活胎，孕约10周声像。
图2 行主动免疫疗法患者成功妊娠超声检查结果
2.4 两组之间临床结局分析 两组临床妊娠率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两组异位妊娠率、流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 不同组别患者临床结局的比较[%(n/n)]
3 讨 论
分别对试验组和对照组行助孕方案，患者一般情况(年龄、胚胎个数、胚胎质量、不孕次数)差异无统计学意义；两组的子宫内膜厚度、LH、P、E2 差异无统计学意义，临床妊娠率差异有统计学意义，这表明子宫内膜厚度、LH、P、E2 对临床妊娠率的没有影响。
研究显示，子宫内膜容受性与子宫内膜厚度、移植窗胞饮突的数量、血流情况、内膜微环境中各种免疫细胞及其细胞因子构成比等诸多因素有关[4]。胚胎种植成功的关键因素是有良好的子宫环境和优质的胚胎[5]。但是在IVF-ET患者中，常常发现许多患者胚胎质量佳，有正常的子宫内膜形态，却在反复移植胚胎中无法成功妊娠。近些年来，许多临床证据表明免疫因素的影响在胚胎反复种植失败中起着重要的作用。
免疫学调查以为，妊娠是一种同种性质的物质移植现象，流产是异种移植排斥的结局[6]。在临床妊娠正常过程中，胚胎是一种半同体抗原，但不受母体排斥而存在，这和蜕膜组织中有正常的免疫微环境有一定的相关性。胚胎源性抗原与母体的免疫系统形成免疫平衡状态，这是胚胎得以存活的前提条件。一旦这种平衡被打破，导致母体与胚胎免疫失衡，将可能造成反复胚胎种植失败或流产的发生，免疫学调控在胚胎种植过程中发挥重要的角色[7]。而淋巴细胞主动免疫治疗可能促进细胞免疫介入免疫耐受，增强封闭抗体，引导母胎界面微环境相互适应，这为探索改善胚胎着床的治疗方法以及阐释RIF的发病机制提供了一定的理论依据[8]。
在胎母接触面的免疫关系中，最具有代表性的是绒毛外细胞滋养叶与母体蜕膜面之间免疫[9]。蜕膜含有T淋巴细胞，多数报道在孕期蜕膜淋巴细胞以CD8细胞为主。在人孕期蜕膜T细胞培养上清液中TH1/TH2出现TH2倾斜。
国外有研究者发现，多次IVF-ET失败妇女外周血中分泌白细胞介素(IL)-10的CD3+/CD8+T细胞明显降低，而分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α的CD3+/CD4+T细胞增高[4]。由此推测Th1为主导的免疫反应增强，可能导致失败的胚胎植入。因此认为，反复胚胎着床失败的患者与习惯性流产的患者同样存在免疫的功能失调。
近年来，国内外大量文献表明淋巴细胞主动免疫对复发性流产有较好的效果，但是关于主动免疫治疗反复胚胎种植失败的报道很少。Coulam等[10]研究认为主动免疫治疗只对那些有异常免疫风险的妊娠失败的妇女有一定疗效，旨在使其活产婴儿的出生率提高。不明原因复发性流产的患者用淋巴细胞主动免疫治疗法的主要原因是淋巴细胞能够使患者免疫反应性增强，从而使得封闭抗体阳性，使得患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的数量提高[11-12]；同时可诱导患者体内TH1/TH2出现TH2倾斜，使母体免疫系统无法识别和杀伤胎儿父系抗原或胚胎，从而获得免疫保护作用，有助于正常妊娠的维持。这个理论与林其德[9]研究相符。有专家意识到，RIF与复发性流产的病理机制或许存在一定部分的相关性。复发性流产与RIF可能是在同种发病机制不同阶段的显示。然而作者应用淋巴细胞对封闭抗体缺乏的反复种植失败患者进行主动免疫治疗，试验组临床妊娠率较对照组有提高，可获得40%的临床妊娠率，这表明淋巴细胞主动免疫治疗对胚胎反复着床失败的患者有一定临床应用价值。根据国内外报道以及该研究，可尝试在RIF患者中根据患者实际情况实施适度的主动免疫疗法，提高反复不孕不育患者的临床妊娠率。
此文章中试验组和对照组的异位妊娠率、流产率相比，差异并无统计学意义，这表明，淋巴细胞主动免疫治疗法对胚胎反复种植失败患者的异位妊娠率、流产率的改善并未起到作用。相关文献显示主动免疫治疗法可以相应降低复发性流产患者的流产率[13-14]。根据患者体内封闭抗体的变化情况衡量主动免疫治疗的疗效，可以预测并指导习惯性流产患者的妊娠及再一次妊娠的临床结局[15]。
根据国内外的研究报道及本研究的调查，淋巴细胞主动免疫治疗可适度的应用于反复胚胎着床失败并封闭抗体阴性的患者。关于国内外淋巴细胞主动免疫治疗对反复种植失败治疗的确切效果仍缺乏大量的前瞻性研究和循证医学证据，仍有待进一步研究与探索。
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�验交流·
10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.030
云南省教育厅基金(2013C172)；九三学社大理白族自治州委调研课题项目(16DJ04)；大理大学博士2016年度博士科研启动费项目(KYBS201612)。 作者简介：何培(1990-)，在读硕士，主要从事辅助生殖实验室技术的研究。△
，E-mail:zrp263000@163.com。
R459.2
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1671-8348(2017)05-0673-04
2016-06-27
2016-08-25)
