王 坚，袁红伶
(1.云南省第一人民医院肾内科，昆明 650032;2.昆明医科大学第一附属医院呈贡分院肾内科，昆明 650500)
论着·基础研究
傣药雅盼对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1/Smads信号转导通路的影响*
王 坚1，袁红伶2△
(1.云南省第一人民医院肾内科，昆明 650032;2.昆明医科大学第一附属医院呈贡分院肾内科，昆明 650500)
傣药雅盼；肾间质纤维化；转化生长因子-β1；单侧输尿管梗阻；大鼠
肾间质纤维化是所有慢性肾脏病进展的重要病理基础，比肾小球硬化更能反映肾脏受损伤的程度[1]。如何抑制肾间质纤维化一直是一个值得探讨的话题。傣药雅盼在民间长期运用于肾炎、风湿性关节炎等的治疗。本研究将从分子生物学角度来证实傣药雅盼在治疗肾衰竭方面的作用，为民族医药的临床应用提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1药物与试剂盒 雅盼由云南省中药研究所提供；盐酸苯那普利(洛丁新)购自北京诺华制药有限公司；转化生长因子(TGF)-β1购自美国Santa Cruz公司；鼠抗β-actin单克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；Smad2、Smad7多克隆抗体购自美国Protech公司；MCP-1购自英国Abcam公司。
1.1.2实验动物 清洁级雄性大鼠120只(6周龄，购自昆明医科大学动物科)，体质量(200±25)g，饲养条件：室温18～25 ℃，相对湿度40%～60%，自由摄入标准饲料，饮用煮沸后冷却的自来水，换垫料1次/天，光照，12 h光照/黑暗，照明时间8：00-20：00。
1.2方法
1.2.1动物造模与分组 120只大鼠分为假手术组(20只)及模型组。模型组又分为5组：生理盐水对照组(对照组)，雅盼低剂量药物组(低剂量组)，雅盼中等剂量药物组(中剂量组)，雅盼高剂量药物组(高剂量组)，苯那普利组，每组各20只。
单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型制作：大鼠右侧卧位，备皮后常规消毒，3%戊巴比妥钠局部麻醉，取左侧背部肋下5 mm作切口，开腹，游离左肾及输尿管，取中上段结扎，之后逐层缝合。假手术组开腹后游离输尿管后即关腹。
1.2.2给药方法 造模次日开始灌胃给药。假手术组与对照组予生理盐水5 mL灌胃；雅盼提液低、中、高剂量组分别为4.0、8.0、12.0 g/(kg·d)；苯那普利组予苯那普利混悬液5 mL/d灌胃，其有效剂量为0.467 mg/(kg·d)，共28 d。
1.2.3标本采集与处理 各组大鼠治疗28 d后颈动脉取血，分离血清后送检；脱颈处死大鼠，取左肾组织，10%甲醛固定，磷酸盐缓冲液冲洗，二甲苯乙醇液脱水，石蜡包埋切片。
1.2.4检测内容及方法
1.2.4.1血清检测 尿酶法检测尿素氮(BUN)、苦味酸法检测肌酐(Scr)。
1.2.4.2组织检测 肾组织石蜡切片后进行HE染色及Masson染色。HE染色行常规显微镜检查，同时计算肾小管损伤指数(TII)。Masson染色在400倍镜下，观察小管间质病变。TII：即半定量分析肾小管间质病变[2]。每张切片随机选10个不含肾小球的视野，400倍光镜下观察，由3个参数进行判断：蛋白管型和肾小管扩张、间质炎性细胞浸润、间质纤维化程度。每个参数按0～3分评价：0分为正常；1分为轻度，视野内损伤小于25%；2分为中度，视野内损伤25%～50%；3分为重度，视野内损伤大于50%。TII评分由肾脏所有视野的损伤等级评分加权平均计算而得。每个样本肾小管间质的评分为0～9分。
1.2.4.3免疫组织化学检测 采用免疫组织化学法,磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照染色,检测 TGF-β1、Smad2、Smad7的表达。每个观察指标在同一标本中制作切片2张,采用不加一抗的方法作阴性对照,同样也在每一组中作2张对照。出现黄褐色反应为阳性,相同部位不出现黄色反应为阴性。 阳性等级判断指标：显色强度、阳性细胞数。显色强度有以下几种表达:无色、黄色、浅黄色、黄褐色。免疫组织化学结果以Qwin550CW型图像信号采集及分析系统进行灰度值测量。灰度值越高表明相应蛋白表达越低,反之则表明相应蛋白表达越高。
1.2.4.4反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA的表达 TGF-β1、Smad2、Smad7 mRNA水平检测参照ABI试剂(SYBR Select Master Mix)RT-PCR操作说明进行，ABI7500荧光定量PCR仪器中进行，以β-actin为内参，运用2-△△t法进行数据计算，△△CT=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)。
1.2.4.5Western blot检测蛋白表达 Western blot检测Smad2和Smad7蛋白。取100 g肾组织匀浆，取上清液，以BCA蛋白试剂盒检测匀浆液中蛋白浓度，将蛋白标本经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，TBST室温封闭后与特异性的Smad2(1∶500)抗体和Smad7(1∶500)抗体共孵育，之后与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体作用、洗涤，最后X线片记录实验结果，计算机成像分析仪，测定X线片上杂交条带的吸光度值，代替蛋白表达量。全部试验均用β-actin作内参，以上每组操作重复3次。
2 结 果
2.1一般情况 各组大鼠伤口愈合良好，无感染。模型组进食量明显少于假手术组，且鼠毛无光泽，同时耸毛、弓背、活动减少。雅盼各组及苯那普利组治疗后，进食有所恢复，但仍不及假手术组，活动较前增加；但鼠毛无明显变化。
实验期间，假手术组及高剂量组无死亡，生理盐水对照组死亡2只，中剂量组死亡2只，低剂量组及苯那普利组死亡1只。各组动物死亡率差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2肾功能检测 造模后28 d模型组BUN、Scr与假手术组比较，明显增高(P<0.05)；但经苯那普利及雅盼高、中、低剂量灌胃后BUN、Scr水平明显低于对照组(P<0.05)；其中苯那普利组与高剂量组BUN、Scr低于中、低剂量组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 治疗后各组大鼠Scr、BUN水平
*:P<0.05,与假手术组比较；△:P<0.05,与对照组比较
2.3肾组织病理改变 光镜下HE和Masson染色显示，假手术组大鼠肾小球正常，肾小管-间质轻微纤维化(面积小于5%)，未见炎性细胞浸润。UUO各组大鼠肾小管上皮细胞空泡化，肾小管扩张明显，部分肾小管萎缩，排列紊乱，肾间质弥漫炎性细胞浸润，Masson染色可见肾间质局灶性纤维化。雅盼各治疗组及苯那普利组，肾小管-间质炎性细胞浸润及肾间质纤维化程度较对照组有所减轻，尤以高剂量组及苯那普利组减轻明显(图1～6)。TII评分显示，UUO大鼠TII评分显着高于假手术组(P<0．05)，但与对照组相比高、中剂量组及苯那普利组TII评分明显改善(P>0．05)，低剂量组与对照组相比TII评分有所降低，但差异无统计学意义(P>0．05)。见表2。
表2 各组大鼠TII评分、TGF-β1、Smad2、Smad7表达的比较
*:P<0.05，与假手术组比较；△：P<0.05，与对照组比较;○:单位为灰度值
图1 各组HE染色情况
图2 各组Masson染色情况
2.4各组大鼠肾脏组织的免疫组织化学结果
2.4.1TGF-β1及Smad2 mRNA表达 假手术组肾组织肾小球和肾小管上皮细胞中无或弱阳性表达。模型组表现为褐色颗粒状沉积，着色较深，呈强阳性表达，主要集中在肾小管上皮细胞，肾小球也可见少量表达，假手术组与各模型组间的灰度值差异均有统计学意义(P<0.05)。低剂量组、中剂量组、高剂量组及苯那普利组之间有不同程度的阳性表达，但均低于对照组。见图3、4。
图3 TGF-β1在各组中的表达情况
2.4.2Smad7 mRNA的表达 假手术组Smad7 mRNA在肾小球着色部位广泛，呈棕黄色颗粒或块状，为强阳性表达，在肾小球的分布多于肾间质，主要见于毛细血管壁、肾小球系膜细胞和肾小球囊上皮细胞。各模型组Smad7 mRNA的表达有不同程度抑制，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组、中剂量组与苯那普利组表达抑制情况有所改善，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量组较对照组相比表达有所增强，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。
图5 Smad7在各组中的表达情况
2.4.3Smad2和Smad7 Western blot蛋白表达 见图6。
M：Marker，D2000；1：假手术组；2：对照组；3：低浓度组；4：中浓度组；5：高浓度组；6：苯那普利组
图6 Smad2、Smad7与β-actin电泳图
3 讨 论
肾间质纤维化是各种肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的必经通路。大量研究证明，TGF-β1是加速肾纤维化的最关键因素[3]。TGF-β1能加剧细胞外基质(ECM)的产生，对ECM基因表达、基质降解、细胞增殖分化、细胞凋亡及免疫功能都具有一定影响[4]，是导致肾小球硬化，肾小管-间质纤维化的重要因素[5]。Smads蛋白是TGF-β家族信号从受体到核的细胞内传导分子，调控细胞膜信号传导，在慢性肾纤维化中，起重要作用[6-8]。Smad2与Smad3 同属受体激活型Smad蛋白(R-Smad)，二者具有92%的同源性[9]。但有学者研究，大鼠敲除Smad3基因后，在TGF-β1刺激下，成纤维细胞依旧可以生成基质,显示 Smad2 是许多基质反应中的特异性调节因子[10-11]。Smad7属于细胞内Ⅰ型受体丝氨酸/苏氨酸激酶的拮抗蛋白，它具有阻止R-Smads磷酸化及反馈调节TGF-β对靶基因转录的作用，是阻断肾组织TGF-β1效应的关键[12-14]。已有不同学者对苯那普利延缓慢性肾衰竭病程进展方面的作用进行研究，结果均表明，该药确实能调节TGF-β1/Smads信号转导通路，抑制肾间质纤维化[15-16]，故本研究中以此药作为西药对照。
UUO是研究肾小管间质纤维化成熟的动物模型。本研究显示，UUO大鼠肾间质炎性细胞浸润，肾小管扩张，坏死,空泡化，间质纤维化，符合慢性肾小管间质纤维化的特点。
傣药雅盼系蕨类卷柏科卷柏属植物。该药已有长期且较为广泛的运用，具有清热利湿，止咳止血，抗炎作用[17]。而近年的研究提示该类药含有大量双黄酮类及阿魏酸棕榈酸-16-醇酯等成分，具有抗病毒 、抗炎、 抗氧化、抗血栓及扩张血管作用[18-19]。本研究发现UUO模型组大鼠肾组织中TGF-β1、Smad2蛋白表达上调，而Smad7蛋白表达下调，TII评分明显升高，肾功能明显下降，而经28 d干预后，雅盼低、中、高剂量组TGF-β1、Smad2蛋白表达较对照组均有不同程度的下调，且差异有统计学意义(P<0.05)，中、高剂量组Smad7蛋白表达有不同程度上调(P<0.05)，而肾脏病理损伤程度较对照组有不同程度减轻：肾间质炎性细胞浸润、肾小管扩张，坏死及间质纤维化程度也有不同程度减轻，肾功能有所恢复，TII评分明显减低，其中、高剂量组及苯那普利组TII评分减低程度优于低剂量组(P<0.05)。
综上所述，傣药雅盼中、高剂量治疗可以下调TGF-β1、Smad2蛋白表达，上调 Smad7蛋白表达，通过调节TGF-β1/Smads信号转导通路，减轻UUO大鼠术后肾脏病变，延缓肾小管损伤及肾纤维化进展。
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EffectofDaimedicineYapanonTGF-β1/Smadssignalingtransductionpathwayinunilateralureteralobstructionrats*
WangJian1,YuanHongling2△
(1.DepartmentofNephrology,YunnanProvincialFirstPeopleHospital,Kunming,Yunnan,650032,China； 2.TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversityChenggongSorting,Kunming,Yunnan650500,China)
Dai medician Yapan;renal interstitial fibrosis;transforming growth factor-β1;unilateral ureteral obstruction;rats
目的观察傣药雅盼对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠转化生长因子(TGF)-β1/Smads信号转导通路的影响，从而探讨该药对肾间质纤维化抑制作用的可能机制。方法120只雄性大鼠行单侧输尿管结扎建立UUO大鼠模型，生理盐水灌胃或给药28 d后收集血清检测尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)，处死大鼠，取其肾组织行HE染色和Masson染色，免疫组织化学法检测TGF-β1、Smad2、Smad7在肾组织的表达；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA的表达；Western blot检测蛋白表达。结果傣药雅盼各剂量组能降低大鼠BUN、Scr水平，并减轻肾小管-间质炎性细胞及肾间质纤维化程度，同时使TGF-β1、Smad2 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05)，而Smad7 mRNA和蛋白表达下调(P<0.05)。结论傣药雅盼各浓度组均可以在一定程度抑制Smad2 mRNA的表达，上调Smad7 mRNA的表达，通过干预TGF-β1/Smads信号转导通路抑制了TGF-β1在肾组织的表达从而对UUO大鼠肾间质纤维化。
R453.9
A
1671-8348(2017)31-4325-04
10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.002
国家自然科学基金资助项目(81460649)。
王坚(1968-)，副主任医师，硕士，主要从事慢性肾衰竭及血液净化研究。△
，E-mail：kmyuanhl@yeah.net。
ObjectiveTo observe the effect of Dai medicine Yapan on TGF-β1/Smads signaling transduction pathway in unilateral ureteral obstruction (UUO) rats,and to explore its possible mechanism in rat renal interstitial fibrosis inhibitory effect.MethodsThe UUO rat model was established by conducting the unilateral ureteral obstruction(UUO) in 120 male rats.Normal saline gavage or medication were performed for 28 d and serum was collected for detecting BUN and Scr.Then the rats were killed for taking the renal tissue and conducting HE and Masson staining.The expression of TGF-β1,Smad2 and Smad7 in kidney tissues were detected by using the immunohistochemical method.The mRNA expression was detected by RT-PCR;the protein expression was detected by Western blot.ResultsVarious Yapan doses groups could reduce the level of serum BUN and Scr in experimental rats,alleviated renal tubular interstitial inflammatory cells and renal interstitial fibrosis degree,meanwhile up-regulated the expression of TGF-β1,Smad2 mRNA and protein (P<0.05),while down-regulated the expression of Smad7 mRNA and protein (P<0.05).ConclusionDifferent concentrations groups of Dai medician Yapan may inhibit Smad2 mRNA expression in some extent,up-regulates Smad7 mRNA expression,inhibits the expression of TGF-β1 in kidney tissues through interfering TGF-β1/Smads signaling transduction pathway,thus obtains a therapeutic effect for inhibiting kidney interstitial fibrosis in UUO rat.
2017-03-24
2017-06-12)
