武鑫玲，姜 娟
(1.郑州人民医院心血管内科，郑州 450053；2.北京大学人民医院老年医学科，北京 100044)
急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心内科常见疾病之一，预后较差，具有较高的病死率，给人们的健康带来严重威胁。AMI是由于心脏的供血血管发生急性闭塞，影响相应的心肌组织的血供而导致短时间内出现缺血、缺氧，甚至发生坏死[1]。传统观点认为，AMI时心肌组织的损伤为不可逆。而最近研究表明，哺乳动物的心肌细胞在AMI时仍未退出细胞周期，因此仍具有再生能力[2-3]。患者的心脏功能在AMI发生早期受到调节会发生心肌重构。他汀类药物是目前临床降脂、降压的常用药物。研究显示，他汀类药物有助于改善心肌重构。瑞舒伐他汀是一种他汀类药物，具有稳定冠状动脉粥样硬化斑块、抗炎、维持内环境稳定，从而发挥调节细胞增殖，保护心肌细胞的作用[4-5]。本研究通过AMI大白兔模型的建立，观察他汀类药物对兔AMI后心肌重构的作用，并探索其中的作用机制，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器与试剂 HPSonos 5500超声诊断系统(美国HP公司)，美国ABI9700RT-PCR扩增仪(美国Thermo公司)；瑞舒伐他汀(阿斯利康制药有限公司，批准文号H20110563)，基质金属蛋白(MMP)-2、-9、-10，骨膜蛋白(Perionstin蛋白)及转化生长因子(TGF)-β1兔多克隆抗体(美国BD公司)。
1.1.2实验动物 大白兔，雄性，18个月龄，体质量(2.41±0.11)kg，合格证号[SCXK(苏)2007-0008]，适应性饲养1周，室温，湿度45%～70%，自由进食饮水。
1.2方法
1.2.1造模与给药方法 首先麻醉兔，于腹腔注射20%乌拉坦(0.4 mL/kg)，固定兔子仰卧于手术台上，将颈部及胸部被毛剪除，将颈部皮肤纵形剪开1.5～2.0 cm，对于皮下组织及肌肉进行分离，使气管及其上甲状腺腺体显露；钝性分离气管并带线，将丝线提起，于气管环之间将气管剪开半周，行气管插管；对呼吸参数，包括呼吸频率、吸呼比及潮气量进行调整；胸骨左缘3 mm将胸部皮肤纵形剪开约4 cm，对皮下、胸大肌与前锯肌进行钝性分离，对胸大肌及前锯肌进行缝合、牵开，使肋骨及肋间肌显露，将肋间肌于第3肋间逐步剪开，使胸膜显露，于呼气时刺破胸膜进入胸腔；撑开肋骨，显露心脏；探查确定左心耳，结扎冠状动脉左前降支近端，13 mm针Prolene线缝扎，出针，打结，探查无出血后关胸，将一根吸引管留置于胸腔内，缝合肋间对术野进行消毒；对合胸大肌与前锯肌并缝合，将胸腔积气积液用针筒抽吸，将吸引管拔出；兔子苏醒后，拔管，对气道血块及分泌物进行清理，气管切口以Prolene线一针缝合，碘伏消毒术野，对合肌肉及皮下，缝合颈部切口。手术后24 h内11只大白兔死亡。将存活的69只兔子分为3组：心肌梗死对照组(MI组，n=20)、瑞伐他汀组(R组，n=22)、假手术组(S组，n=27)。S组并不在冠状动脉处结扎仅穿线；R组兔子灌胃给予10 mg·kg-1·d-1瑞舒伐他汀钙，每日1次，灌胃处理4周；MI组建立AMI后不予任何操作。
1.2.2超声心动图检查 干预结束使用HP Sonos 5500超声诊断系统(频率12 MHz)对3组大白兔进行超声心动图检查。检测指标包括左心室射血分数(LVEF)、左心房直径(LAD)、左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室短轴缩短率(LVFS)等。
1.2.3左心室梗死面积计算 将左心室切片置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中染色30 min，蒸馏水冲洗后，心肌梗死区未着色显示灰白色，非梗死区经过染色后显示深红色。采用ImagePro Plus软件(version 6.0)计算梗死面积和左心室总面积，以梗死面积/左心室总面积表示梗死面积的大小。
1.2.4检测细胞凋亡率 常规TUNEL法，由福建迈新生物技术开发有限公司提供试剂盒，检测心肌组织中的凋亡细胞。光镜观察细胞核棕色为阳性，凋亡指数 (AI) =视野凋亡数/视野内细胞总数×100%。
1.2.5检测心肌梗死边缘区Caspase-3的表达 将心肌组织用机械法剪碎，过滤并制成单细胞悬液，将5 mL单细胞悬液加入试管中，常规离心后去上清液，加入100 μL固定液后混匀，静置15 min。加4 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，常规离心，去上清液，加入100 μL裂解液，室温静置入5 min。加5 μL美国Santa Cruz Biotechnology的Caspase-3抗体，混匀，避光静置15 min。加4 mL PBS，离心，去上清液，加PBS 0.5～1.0 mL。使用日本BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪检测。
表1 3组大白兔超声心动图指标比较
a：P<0.05，与S组相比；b：P<0.05，与MI组相比
1.2.6检测p-p38蛋白和p38 常规方法提取样品蛋白，标化后聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜后，以5%的脱脂牛奶1∶200稀释兔单抗p-p38抗体(美国Santa Cruz Biotechnologyy)、兔单抗p38抗体(美国Santa Cruz Biotechnology)，1∶1 000稀释兔多抗actin抗体(武汉博士德公司)；置摇床4 ℃孵育过夜;将辣根过氧化物酶(HPR)标记的鼠、兔二抗用5%脱脂牛奶1∶200稀释，常温摇床上孵育聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，之后于凝胶成像系统曝光。
2 结 果
2.13组大白兔超声心动图指标比较 3组间超声心动图指标比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与S组相比，MI组与R组的LAD、LVDd和LVDs均显着增加，同时LVEF和LVFS降低(P<0.05)；R组LAD、LVDd和LVDs与MI组比较差异无统计学意义(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI组(P<0.05)，见表1。
2.23组大白兔心肌梗死面积比较 S组心肌梗死面积为0，MI组(37.92±4.29)%与R组(36.71±3.98)%间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3瑞伐他汀对兔子心肌梗死边缘区细胞凋亡的影响 MI组[(24.42±2.52)%]和R组[(9.31±0.31)%]凋亡指数 (AI)显着高于S组[(2.65±0.32)%](P<0.05)，R组AI较MI组显着降低(P<0.05)。
2.4不同组心肌梗死边缘区Caspase-3的表达情况 R组及MI组心肌梗死边缘区Caspase-3表达较S组明显升高，而R组较MI组显着降低(P<0.05)，见图1。
2.5不同组心肌梗死边缘区相关蛋白表达情况 MI组、R组、S组p38表达均未见明显差异，MI组和R组p-p38表达较S组显着升高，而R组较MI组显着降低(P<0.05)，见图2。
a：P<0.05，MI组与S组比较；b：P<0.05，R组与MI组比较；c：P<0.05，R组与S组比较
图1各组心肌梗死边缘区Caspase-3的表达
A：Western blot法检测兔心肌梗死边缘区p38、p-p38的表达；B：半定量分析；a：P<0.05，S组与MI组比较；b：P<0.05，R组与MI组比较；c：P<0.05， R组与S组比较
图2各组兔心肌梗死边缘区p38、p-p38的表达
3 讨 论
AMI后心肌细胞受损，导致心室肥厚、扩张，心肌收缩力下降，心肌纤维化增加，最终导致心力衰竭，给患者带来严重后果[6-7]。本研究中建立AMI大白兔模型，以探究AMI的发病机制，以及可能存在的病理变化。
本研究在对兔子模型进行不同干预4周后行超声心动图检测，结果显示，与S组相比，MI组与R组的LAD、LVDd和LVDs均显着增加，同时LVEF和LVFS降低(P<0.05)，说明大白兔在心肌梗死后出现心脏扩大、左心室收缩功能不全。另外，R组LAD、LVDd和LVDs与MI组比较差异无统计学意义(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI组(P<0.05)，提示瑞舒伐他汀能増强心肌梗死大白兔的左心功能。但MI组与R组间的心肌梗死面积比较并未见显着差异(P>0.05)，提示瑞舒伐他汀并不能达到显着地减少心肌梗死面积的目的。
心室重构是心肌细胞凋亡所引起，有研究发现，心肌梗死大鼠除梗死区外，梗死边缘区及非梗死区亦可检出细胞死亡，而这是引起左心室重塑和晚期心功能不全的重要因素[8-9]。本研究结果显示，R组心肌细胞AI较MI组显着降低(P<0.05)，提示瑞伐他汀治疗能减少心肌细胞凋亡，可能通过抑制心肌凋亡，而使心功能改善。
目前认为他汀类药物可能通过抑制心肌凋亡而使心功能改善，分析其抑制心肌细胞凋亡可能的作用机制[10-12]：(1)通过抗氧化作用抑制心肌凋亡；(2)通过调控丝氨酸-苏氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶，下调Caspase-3 活性。Caspase-3在细胞的凋亡中起关键作用，是凋亡途径中的执行者。p38属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中的一个主要成员，研究发现，大鼠心肌梗死后，p38并未增高，但p-p38在心肌梗死后7 d时升高2倍以上，p-p38能激活凋亡程序中最后的执行者Caspase-3的活性，使凋亡通路启动，活化的Caspase-3又能导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞发生凋亡[13-15]。本研究中，R组p-p38、Caspase-3的表达低于MI组，推测瑞舒伐他汀可能通过抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，从而抑制心肌细胞凋亡，改善心功能。结果表明瑞舒伐他汀能抑制心肌凋亡、改善心功能，但无法逆转已梗死的心肌组织，提示已坏死的心肌组织无法通过药物恢复正常功能。因此，早期对AMI患者使用保护心肌细胞药，避免梗死进一步加重是改善患者预后、提高生存率的重点。
综上所述，瑞舒伐他汀可以使AMI大白兔的心脏功能显着改善，可能通过抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，抑制心肌细胞凋亡，改善心室重构。
