苏 倩，吴 洁，杜佳慧，杨 凡，袁濮玉，刘松柏，邱秀芹
(苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室，苏州 215009)
DNA分枝结构特异性内切酶-1(flap endonuclease 1，FEN1)作为一个结构特异性核酸酶，除在DNA复制中起着至关重要的作用外，在DNA损伤修复过程中也起着重要作用[1-4]。目前阐述得较清楚的是在碱基错配修复(base excision repair，BER)及Pol α合成错配修复通路(α-segment error editing，AEE)中的功能[1-5]。前期研究结果显示，FEN1纯合敲除小鼠胚胎致死，说明FEN1功能的重要性[6]。为研究FEN1在细胞代谢过程中的具体功能，研究人员往往采用转染外源FEN1表达质粒或干扰RNA进入细胞，通过升高或降低FEN1表达的方式研究FEN1在不同条件下的具体功能[7-9]。
转录组测序技术又称RNA测序(RNA-sequencing，RNA-Seq)，是指利用高通量测序技术，快速全方位地获取在某一条件下某一物种特定组织及器官几乎全部转录本，目前广泛应用于针对不同条件下细胞内基因表达水平差异的检测，从而研究条件改变引起基因表达改变的群簇，为从分子机制上阐明细胞表型改变的内在驱动力提供依据[10]。荧光定量PCR技术自开发应用以来，因为灵敏、准确、高效、特异等特点一直被作为对特定组织细胞中特定基因数量进行定量的金标准，同时经常被用来验证转录组测序的结果[11]。为全面研究FEN1在细胞中的具体功能，本研究从前期FEN1基因敲低细胞株及对照细胞株的转录组测序结果中筛选若干个差异表达的基因，设计引物，利用荧光定量PCR技术进行结果验证，为进一步具体分析研究转录组测序数据奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株 人肾上皮细胞系293T细胞和本实验构建的FEN1敲低细胞SG67。
1.1.2主要仪器与试剂 DMEM(高糖)培养基、胎牛血清、胰酶均购自美国HyClone公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；FEN1鼠源一抗、羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自美国Genetex公司；反转录试剂盒购自日本TakaRa公司；SYBR Green荧光定量PCR试剂购自瑞士罗氏公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司进行合成。ABI Step One Plus 实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养 293T细胞和SG67细胞常规复苏后，接种于50 mL培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃ 5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。80%细胞融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2.2总RNA的提取 取对数生长期细胞，弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，用PBS吹细胞，收到1.5 mL EP管中，3 000 r/min离心1 min，弃上清液，置于-80 ℃冰箱中或者立即实验。加入适量的Trizol试剂，使细胞充分裂解；室温静置5 min后，转移到1.5 mL离心管中；振荡器剧烈混匀15 s，室温放置3 min；再在4 ℃条件下10 000 r/min离心15 min；提取上清液，在装有上清液的EP管中加入等体积异丙醇溶液，充分混匀，室温静置15～20 min；在4 ℃条件下10 000 r/min离心10 min，离心后管底絮状沉淀即为RNA。用无RNase水溶解稀释RNA样品，紫外吸收法测定总RNA的浓度及纯度，样品RNA 260 nm与280 nm处吸光度(A)值比值(A260/A280)为1.8～2.1之间。变性琼脂糖凝胶电泳评估总RNA的完整性。
1.2.3反转录合成cDNA 根据反转录试剂盒说明先配制10 μL体系：Oligo dT 2 μL、dNTP 2 μL、RNA 4 μL、无RNase双蒸水(ddH2O)12 μL。65 ℃，5 min，冰上急冷2 min；取上述溶液20 μL，加入5×primer script buffer 8 μL、RNase inhibifor 1 μL、Primer script 2 μL、无RNase ddH2O 9 μL，配成总体系40 μL。PCR仪上设计程序：30 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，70 ℃ 15 min，4 ℃ 10 min。所得溶液置于-20 ℃保存。
1.2.4荧光定量 PCR 表达验证
1.2.4.1转录组测序 通过Ⅰllumina Hiseq 2500高通量测序平台测序，在RNA序列分析中，可将定位到基因组区域的序列数量作为计算基因的表达水平。为了解293T(Ctrl)和293T的FEN1敲低细胞(FEN1KD)中基因表达差异情况，本研究采用RSEM软件计算基因表达水平，衡量基因表达水平的标准为FPKM值。在构建cDNA文库时，FPKM值将随机打断的片段作为分析单位，并把FPKM值作为基因在细胞中的表达水平。3次独立重复实验，根据转录组测序结果找出差异表达的基因。
1.2.4.2引物设计 根据高通量测序结果，筛选出10个预测有表达差异基因序列，利用 Primer premier5.0软件进行引物设计，并经上海生工生物工程有限公司进行合成。通过常规PCR反应对目的片段进行扩增，并摸索反应最适条件。具体实验过程根据Takara PCR试剂盒的说明书进行操作。引物信息见表1。
表1 PCR引物信息
1.2.4.3荧光定量PCR 采用SYBR Green Ⅰ法进行荧光定量PCR，验证转录组测序结果的准确性。以反转录产物cDNA为模板，严格按照罗氏荧光定量反应试剂盒说明书进行实验操作。每个模板设置3个复孔，每个基因设置3个阴性对照，总反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。独立3次重复实验。荧光定量PCR扩增挑选基因所用引物与表1引物序列相同。
2 结 果
2.1FEN1敲低细胞系验证 通过蛋白质印迹法(Western blot)检测293T细胞和SG67细胞表达FEN1蛋白情况，结果显示与对照293T细胞相比，SG67细胞的FEN1蛋白表达水平明显下降，见图1。
M:蛋白标记物
图1 FEN1敲低细胞株SG67的FEN1蛋白表达
2.2转录组结果与分析 通过Ⅰllumina Hiseq 2500高通量测序平台对293T(Ctrl)和293T的 FEN1敲低细胞(FEN1KD)进行转录组测序，并从转录组测序结果中筛选出10个差异表达的基因，其表达水平见表2。
表2 转录组测序预测的基因表达水平
续表2 转录组测序预测的基因表达水平
2.3筛选基因PCR扩增结果 选取293T细胞的cDNA经普通PCR扩增10个基因，程序设定：95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环。琼脂糖凝胶电泳结果显示，LC7A3、MAGEB2、HBE1、SLC6A11、ITPKB、SPINT和EVA1C等7个基因都有表达，且条带单一，见图2。
M：DL 2000；1：SLC7A3；2：MAGEB2；3：HBE1；4：SLC6A11；5：ITPKB；6：SPINT1；7：EVA1C
图2 293T细胞中差异表达基因的PCR产物电泳图
2.4筛选基因荧光定量检测结果 根据转录组测序及普通PCR结果，选取在两种细胞中差异表达并经普通PCR扩增的条带单一的7个基因，通过荧光定量PCR检测这7个基因分别在293T和SG67细胞中的表达情况，每个基因的扩增进行了3次实验重复。荧光定量PCR结果显示与转录组测序结果基本一致。利用定量PCR检测方法发现ITPKB与EVA1C基因在两种细胞株中表达虽然有差异，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、图3。
*：P<0.05，与Ctrl比较
图3与Ctrl比较FEN1KD荧光定量数据分析结果
表3 与Ctrl比较FEN1KD荧光定量数据分析结果
3 讨 论
基因组DNA携带着生命近乎完整的信息，却时刻面临着各种的损伤危险。这些致使DNA损伤的因素包括来自内源的代谢产物与来自体外环境来源的持续攻击[12-13]。FEN1作为分枝结构特异性核酸酶，在DNA复制冈崎片段成熟过程中起着不可替代的作用。同时，FEN1在DNA修复通路中也具有重要作用。FEN1纯合敲除小鼠模型胚胎致死。因此，为研究FEN1在低表达情况下细胞内基因的表达差异，以及所影响的细胞内代谢通路改变情况，本课题组前期构建了FEN1敲低细胞株SG67，并利用转录组测序方法对SG67及野生型对照细胞进行了转录组水平基因差异表达比较，获取了大量的基因表达差异数据。
为验证转录组测序结果的可靠性，本研究采用了目前相对灵敏、准确的荧光定量PCR方法。从选择的10个差异基因中，成功设计了其中7个基因的扩增引物，并得到了单一可靠的DNA条带。荧光定量分析结果与转录组测序结果相比较，7个基因的表达差异性均为一致。然而，ITPKB与EVA1C两个基因利用荧光定量PCR方法在两种细胞株中检测到表达有差异，但差异无统计学意义(P>0.05)，反映转录组学数据后续定量PCR检验的必要性。另外检测的5个基因中，SLC7A3及SLC6A11均属于可溶性载体蛋白家族，对氨基酸的转运具有重要作用[14]。MAGEB2基因属于黑色素瘤超级家族成员，在肿瘤的发生过程中起重要作用[15]。HBE1基因为血红蛋白的一个亚基，连同以上几个基因均在FEN1敲低细胞株中表达下降，说明FEN1的下降导致蛋白转运功能受阻，肿瘤发生等相关基因的表达发生改变。在FEN1敲低细胞株中表达上调的SPINT1基因属于细胞生长因子激活物的抑制剂，具体调控机制还有待进一步的研究[16]。
综上所述，本研究为进一步开发、分析转录组测序结果的可行性奠定了基础，为进一步研究FEN1在细胞内的代谢通路情况奠定了基础。
