宋 鑫，张 俊，魏立强，郭文渊，王仕祺，陈承魁△
(1.中国人民解放军第九〇七医院药学科，福建南平 353000；2.福建医科大学科技处，福州 350000；3.空军军医大学第一附属医院胃肠外科，西安 710032)
结肠癌具有早期侵袭及转移的特点，其生物学恶性程度高，严重危害人类健康。结肠癌发病率呈年轻化态势，近年来青年人结肠癌发病率较以往有了明显的升高趋势，提高早诊率及结肠癌救治水平迫在眉睫[1]。现阶段结肠癌治疗仍主要依靠手术、放疗及化疗治疗，外科手术技术的不断提高及新的化疗药物的发展在很大程度上使得结肠癌的救治水平得到一定的改善，但仍有很多患者无法接受手术治疗，化疗药物由于其较严重的毒副反应使患者无法耐受，结肠癌病死率仍居高不下。中国传统医学中医中药的发展弥补了这一缺陷[2-3]。黄芪味甘，性温，有健脾理气的功效，得益于其低毒副作用、高效及多靶点的优势，黄芪已广泛应用于结肠癌抑制肿瘤生长、减轻化疗副反应、放疗增敏以及改善患者症状[4-7]。本研究基于黄芪治疗结肠癌的基础，研究黄芪多糖对结肠癌HT-29细胞生长作用的影响，探讨黄芪多糖抑制结肠癌HT-29细胞增殖的作用机制，为黄芪治疗结肠癌提供实验和理论基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株 HT-29人结肠癌细胞株系购自中国科学院上海生命科学研究所。
1.1.2药物及试剂 黄芪多糖购自森弗生物公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Amresco公司；MCCOY′S 5A培养基购自北京Macgene公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Amresco公司；胰蛋白酶购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；碘化丙啶(PI)周期检测试剂盒购自美国BD公司；小鼠免疫组化染色S-P检测试剂盒，浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.1.3实验仪器 细胞培养箱购自德国Heracus公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；离心机购自德国Eppendorf公司；紫外分光光度计购自美国Bio-Rad公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司；超净工作台购自西安净化仪器厂；移液器购自德国Eppendorf公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养、黄芪多糖配制及实验分组 细胞在37 ℃、5%CO2孵箱中培养于含10%胎牛血清的MCCOY′S 5A培养液中，适时使用胰蛋白酶进行消化传代。超净工作台内无菌条件下用MCCOY′S 5A培养液溶解黄芪多糖粉末呈不同浓度的黄芪多糖混合培养液，使黄芪多糖的终浓度分别为50、100、200 μg/mL，设置分组如下：对照组加入200 μL培养液，黄芪多糖A、B、C组分别加入含黄芪多糖50、100、200 μg/mL的黄芪多糖混合培养液200 μL。
1.2.2MTT法检测细胞增殖 采用MTT法检测 细胞增殖，选取对数生长期HT-29细胞，以2×104个/mL的浓度接种于96孔板中培养，每孔200 μL，共接种4块板，于37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h待细胞完全贴壁后，按照倍比稀释方法，将细胞培养基更换为终浓度为75、125、250、500、1 000 μg/mL的黄芪多糖混合培养液200 μL，对照组为不含黄芪多糖的培养液200 μL，根据浓度不同将实验分为6组，每组样本设置5个副孔，其中1个副孔为只加培养液不含细胞的空白对照用以排除试剂对实验结果的影响，分别在培养0、24、48、72 h各取出1块96孔板每孔加入MTT液 25 μL(5 mg/mL)，将该96孔板继续孵育4 h后每孔加入DMSO液200 μL，酶标仪上在490 nm波长下检测各组样本吸光度值，分别记录4块板上各组细胞的吸光度值，根据吸光度值绘制生长增殖曲线。
1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 采用Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)流式细胞仪检测细胞凋亡，选取对数生长期HT-29细胞，根据细胞分组情况对各组细胞进行处理，收取各组细胞样本，磷酸盐缓冲液(PBS)液漂洗后使用胰蛋白酶消化，加入PBS反复漂洗，轻轻吹打制备单细胞悬液，细胞计数浓度约为1×106个/mL，离心收取细胞沉淀后使用500 μL固定液固定，依此加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，混匀后室温条件下避光孵育10～15 min，流式细胞仪检测。
1.2.4细胞周期检测 采用PI周期检测试剂盒流式细胞仪检测细胞周期，细胞处理同凋亡检测，在6孔板内培养细胞，对照组加入2 mL培养液；黄芪多糖组加入2 mL终浓度为100 μg/mL黄芪多糖混合培养液，48 h后收集细胞加入细胞周期检测试剂盒溶液A 250 μL，充分混匀后室温条件下孵育10 min，然后加入溶液B 200 μL，继续室温孵育10 min后加入预冷的C液200 μL，避光条件下冰浴10 min，流式细胞仪检测。
2 结 果
2.1黄芪多糖抑制HT-29细胞增殖
2.1.1黄芪多糖抑制HT-29细胞增殖的半数致死量(IC50) 检测24 h黄芪多糖对HT-29细胞增殖的抑制作用，MTT法检测结果显示，与对照组比较，黄芪多糖在75 μg/mL以上时，对HT-29细胞具有较明显的抑制增殖作用，且当其浓度大于200 μg/mL时，24 h细胞存活率低于25%，由Graphpad软件求得其IC50值为92.49 μg/mL(图1)，其95%可信区间(CI)为78.32～109.20 μg/mL，故选择黄芪多糖50、100、200 μg/mL为实验分组浓度。
2.1.2不同浓度黄芪多糖对HT-29细胞增殖能力的影响 对照组及黄芪多糖A、B、C组分别在培养第0、24、48、72 h时应用MTT法检测黄芪多糖对HT-29细胞增殖的抑制作用，结果显示黄芪多糖可抑制人结肠癌细胞HT-29的增殖，且当浓度小于200 μg/mL时，随着黄芪多糖浓度的增高其抑制增殖作用增强，抑制作用呈剂量依赖型，见图2。
图1 黄芪多糖抑制HT-29细胞增殖的IC50
a:P<0.05；b：P<0.01,与对照组比较
图2各组HT-29细胞增殖能力比较
2.2黄芪多糖促进HT-29细胞凋亡 在培养第48 h时Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，与对照组比较，黄芪多糖A组仅晚期凋亡率差异有统计学意义(P<0.05);而黄芪多糖B、C组早期凋亡率及晚期凋亡率差异均有统计学意义(P<0.05)，且晚期凋亡率均明显增高(P<0.01)，见表1。
表1 黄芪多糖对HT-29细胞凋亡的影响
a：P<0.05,b:P<0.01，与对照组比较
2.3黄芪多糖对HT-29细胞具有细胞周期阻滞作用 培养48 h，与对照组比较，黄芪多糖组HT-29细胞G0/G1期细胞数目增加(P=0.0186)，S期细胞数量明显减少(P=0.0087)，G2/M期细胞数目无明显变化(P>0.05)，见表2。
表2 两组HT-29细胞周期细胞数量比较
a：P<0.05，与对照组比较
3 讨 论
现代中医认为大肠癌发生主要由外感六淫、饮食不节、情志失调所导致的正气亏虚、气血失调、毒邪蕴结大肠而导致，晚期大肠癌常表现为脾肾亏虚、气血不足，术后气血两虚，化疗使患者脾气不足是大肠癌患者症状难以改善的根本[8]。研究证实，内服中药对大肠癌临床症状的缓解及化疗毒副作用的减轻有明确疗效，临床治疗大肠癌常用枳实消痞丸、参苓白术汤等经方，亦使用康艾注射液、康莱特注射液等中成药注射液，扶正的同时兼顾攻邪，健脾益气，在这方面取得了确切的治疗效果[9]。中医外治法作为内服中药的补充可通过局部给药直达病灶局部，达到缓解大肠癌患者便秘、便血、肠胀气等并发症的目的，同时可以缩小肿瘤大小达到治疗效果。中药灌肠、针灸疗法、穴位注射、中药外涂、中药坐浴、热奄包、封包等在临床上广泛用于大肠癌的中医外治[9]。
黄芪性喜凉爽，耐寒耐旱，产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地，属补气良药，以补虚为主，可有效增强机体免疫功能，有保肝利尿、抗衰老、抗应激、降压以及广谱抗菌功效[10]，黄芪多糖是黄芪的主要生物学活性成分，其组成为多糖和黄芪苷，黄芪苷分为黄芪苷Ⅰ、黄芪苷Ⅱ、黄芪苷Ⅳ，其中生物活性最好的是黄芪苷Ⅳ即黄芪甲苷，黄芪甲苷能增强机体免疫力、提高机体的抗病能力及抗肿瘤功效，有研究证实，黄芪甲苷对结肠癌[11-12]、乳腺癌[13]、胃癌[14]、宫颈癌[15]、肝癌[16]、胰腺癌[17]等癌症都有治疗作用。黄芪可以通过影响细胞周期相关蛋白的表达，阻滞细胞增殖周期，抑制肿瘤细胞增殖[18]；黄芪还可以影响细胞凋亡信号转导途径，促进肿瘤细胞凋亡[19]；黄芪亦可通过调控癌基因及抑癌基因表达抑制肿瘤细胞增殖、转移起到抗肿瘤目的；其抗氧化应激功效可有效清除和抑制自由基，逆转肿瘤化疗耐药及辅助化疗药物抗肿瘤治疗等。
王倩竹等[20]通过90例结直肠癌患者治疗研究比较认为中药对方(黄芪、角针)对结直肠癌患者术后肠道屏障功能损害有一定的保护作用，在肠功能恢复、减轻毒素吸收和降低致炎因子水平方面可能优于西药；阎力君等[2]通过体外实验的方法得出结论认为黄芪多糖对结肠癌细胞SW620 具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，其诱导凋亡机制可能是通过线粒体凋亡通路实现；有研究证实黄芪甲苷在结肠癌的治疗中能够通过抑制自噬增强西妥昔单抗(CTX)的抗肿瘤细胞增殖作用。
本研究应用药物不同浓度梯度抑制HT-29细胞增殖，计算出黄芪多糖抑制HT-29细胞增殖的IC50，而后根据IC50值设置不同的黄芪多糖浓度作为实验分组，通过MTT实验，检测不同浓度黄芪多糖对HT-29细胞增殖能力的影响；利用流式细胞仪分别检测不同浓度黄芪多糖对HT-29细胞凋亡及周期的影响。结果表明：黄芪多糖抑制人结肠癌细胞HT-29的增殖，当浓度小于200 μg/mL时，随着黄芪多糖浓度的增高其抑制增殖作用增强，抑制作用呈剂量依赖型；黄芪多糖可以促进HT-29细胞凋亡，黄芪多糖使HT-29细胞的生长停滞在G1期,说明黄芪多糖对HT-29细胞具有周期阻滞作用，其主要为G1期阻滞。
本研究通过计算黄芪多糖作用于HT-29细胞的IC50,在结肠癌HT-29细胞系中证实了黄芪的抗肿瘤作用，研究结果认为，黄芪治疗结肠癌的抗肿瘤机制是黄芪多糖可使结肠癌HT-29细胞增殖受到抑制，细胞凋亡增加，细胞阻滞于G1期。本研究为黄芪多糖用于结肠癌治疗可提供新的理论依据，并为进一步研究打下基础。
