爱康方含药血清对小鼠Lewis细胞PI3K和AKT mRNA水平的影响研究*

马 科，林 莹，戴永福，马治国，周丽萍，李巧玲，伏柏浓，夏淑敏，田亚佳

(1.宁夏医科大学，银川 750004；2.银川市中医医院，银川 750001；3.宁夏医科大学附属回医中医医院，宁夏吴忠 751100；4.宁夏医科大学总医院，银川 750004；5.银川市明德中医医院，银川750001)

有报道表明，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)通路中多个组分可作为单独或联合治疗肺癌的靶点，PI3K的过表达，涉及激活一个复杂信号网，在肺癌细胞中沉默催化的亚基PI3K可以减少非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的增殖[1]，故PI3K是其癌症治疗理想靶点[2-3]。国内对于PI3K/AKT实验在中医领域内的相关研究较少，目前除单味中药外，复方中药对其通路的研究较之更少，尤其对于Lewis细胞关于复方对其通路的研究。因此，从复方角度出发，爱康方具有清热、化痰、散瘀散结、解毒、排脓、抗癌作用，在前期已证实该方促进Lewis细胞凋亡的实验基础上[4]，重新选取PI3K/AKT信号传导途径，以Lewis细胞作为研究对象，沿袭课题组前期制备含药血清的方法，以20%浓度为最佳含药血清将其进行细胞培养[5-6]。观察爱康方含药血清对小鼠Lewis细胞PI3K和AKT mRNA水平的影响，进而探讨该方对其细胞的凋亡作用是否与PI3K/AKT信号通路有关，进一步明确抗NSCLC的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级雄性SD大鼠80只,体质量(250±20)g，生产许可证号：SCXK(宁) 2016-0001，购自宁夏医科大学动物实验中心。

1.1.2细胞株 小鼠Lewis细胞株(KG070)购自江苏南京凯基生物公司。

1.1.3试剂与仪器 爱康方由金荞麦、通关藤、生薏米、桃仁、紫珠叶、三七、血余炭及花蕊石组成，购自明德药业公司。臭壳虫购自云南楚雄市元谋县元马镇，环磷酰胺针粉剂购自宁夏医科大学肿瘤医院门诊部(批号：06257008，规格：0.2 g/支)。天根RNA提取总试剂盒(批号:DP419)、第一链 cDNA 合成逆转录试剂盒(批号:K1622)、DBI/荧光MIX试剂盒(批号:2043)、PIK3ca和AKT1基因的引物购自上海生工生物有限公司，来源小鼠的内参引物GAPDH(编码：PHS04)。CO2培养箱(5510.NO-US ENUAIR)，超净工作台(BCM型-SJAT-1300A)，酶标仪(美国BIO RAD-680 XMarkTMMicroplate)，倒置显微镜(日本OLYMPUS-CKX31)，Image pro-plus相机显微镜(US-OLYMPUS DP73)，实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD iQ5)。

1.2方法

1.2.1药物制备[7]爱康方：金荞麦30 g、通关藤30 g、薏苡仁30 g、桃仁12 g、紫珠叶30 g、臭壳虫6 g、化雪丹(由三七、花蕊石、血余炭组合)20 g，共158 g，药品鉴定后参照人与动物体表面积换算及课题组前期实验所采用传统水煎药物制备法[6-7]，药液浓缩致每1 mL含生药量分别为1.58 g(低剂量)、3.16 g(中剂量)、4.74 g(高剂量)，相当于临床等效计量的1、2、3倍。 所有药物储存条件为4 ℃备用。

1.2.2含药血清的制备[5-6]参照前期课题组制备含药血清方法并重复实验步骤，将SD大鼠分为生理盐水对照组(NS组)，爱康方低、中、高剂量组，环磷酰胺组(CTX组)，低、中、高剂量联合CTX组(低剂量+CTX组、中剂量+CTX组、高剂量+CTX组)，每组10只。给药方式:已浓缩的低、中、高剂量的爱康方一次给予1×106mg/mL灌胃，每天2次，CTX按20 mg/kg于第1、3、5、7天腹腔注射。第7天给药结束3 h后，用10%水合氯醛(0.3 mL/kg)将大鼠麻醉进行心脏取血，静置35 min，4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，在 58 ℃水浴灭活35 min，0.22 μm滤器过滤后同组内进行混合于-79 ℃保存备用。

1.2.3细胞培养及分组 用含1%双抗、10%胎牛血清高糖型培养基培养Lewis细胞，将其培养瓶放在38 ℃、5% CO2条件下的培养箱内，待第2天细胞铺满瓶底约80%进行传代，最后取对数生长期细胞进行实验。依据SD大鼠分组对应所制备的含药血清，每组均调配成20%最佳含药血清一一对应干预细胞，使之细胞分组为实验组(低剂量组、中剂量组、高剂量组、CTX组、低剂量+CTX组、中剂量+CTX组、高剂量+CTX组)，对照组为NS组，再补充只加DEME培养基作为空白对照组。

1.2.4real-time PCR检测PI3K和AKT mRNA水平 将2.0×106个Lewis细胞接种于25 cm2透气培养后放于培养箱瓶继续培养，待药物干预24、48 h后，依照RNA总提取试剂盒步骤操作，提取的RNA经浓度纯度比对且依照反转录添加范围体系添加后上PCR仪机，反应获得cDNA样板按照DBI/荧光 qPCR MIX试剂盒说明书中反应体系添加到pcr八排管(每组设3个复孔)后在BIO-RAD iQ5实时荧光定量PCR仪上进行扩增。PCR反应条件，95.0 ℃ 2 min;95.0 ℃ 10 s,58.0 ℃ 30 s,72.0 ℃ 30 s,40 个循环，启用数据和实时分析；55.0～98.0 ℃ 10 s,每两个循环数增加 0.5 ℃,共87 个循环,溶解曲线数据收集分析启用;4.0 ℃ 1 min。由NCBI数据库检索获得PIK3ca(NM_008839.2)、AKT1(NM_001165894.1)基因序列送至上海生工生物有序公司所设计引物序列。PIK3ca：正义链5′-GGT GGA ATG AAT GGC TGA AT-3′，反义链5′-CGG ACA GTG CTC CTC CTT AG-3′；AKT1：正义链5′-AGA TTG TGT CTG CCC TGG AC-3′，反义链5′-AGC CCG AAG TCC GTT ATC TT-3′；内参：GAPDH(即用型)。

图1爱康方含药血清作用Lewis细胞不同时间点PI3K、AKT溶解曲线

2 结 果

2.1溶解曲线 图1所示溶解曲线为单峰，基因设计引物具有特异性，扩增产物单一。

表1 爱康方含药血清作用小鼠Lewis细胞24、48 h PI3K mRNA水平比较

2.2爱康方含药血清对小鼠Lewis细胞PI3K mRNA水平的影响 24 h时NS组及各实验组PI3K mRNA水平均低于空白对照组(P<0.05)；中剂量组、低剂量组、高剂量组PI3K mRNA水平逐次降低但高于CTX组，中、低剂量+CTX组PI3K mRNA水平逐渐低于CTX组(P<0.05)。48 h时，NS组PI3K mRNA水平高于空白对照组(P<0.05)，低剂量组、CTX组PI3K mRNA水平仅稍低于空白对照组(P<0.05)；NS组>空白对照组>低剂量组>CTX组>中剂量+CTX组>高剂量组>高剂量+CTX组>低剂量+CTX组>中剂量组。48 h中剂量、高剂量、高剂量+CTX组PI3K mRNA水平低于24 h，但48 h低剂量组、CTX组、低剂量+CTX组、中剂量+CTX组PI3K mRNA水平并未明显低于24 h，转录水平未随时间点设置而降低，见表1。爱康方不同剂量及不同剂量协同CTX含药血清作用小鼠Lewis细胞PI3K mRNA水平有所降低。

表2 爱康方含药血清作用小鼠Lewis细胞24、48 h AKT mRNA水平比较

2.3爱康方含药血清对小鼠Lewis细胞AKT mRNA水平的影响 24 h时NS组AKT mRNA水平明显低于空白对照组，除低剂量组，其余各实验组水平均明显低于空白对照组(P<0.05)。低、中、高+CTX组和中、高剂量AKT mRNA水平低于CTX组。48 h时各组AKT mRNA水平明显低于空白对照组(P<0.05)，CTX组、低、高剂量组及中、高剂量+CTX组水平降低明显。两个时点除低、高剂量组、CTX组，其余各组转录水平降低不明显，见表2。爱康方及不同剂量协同CTX含药血清可降低小鼠Lewis细胞AKT mRNA水平。

3 讨 论

近年来有大量文献报道PI3K/AKT信号通路在肿瘤侵袭、转移的调控方面发挥了重要作用[8]，在NSCLC的研究方面亦有关于该通路能发挥促使细胞凋亡作用的报道[9]。该信号通路的激活主要是由多种因子跨膜刺激后激活了PI3K，使产生PIP3与胞内PH域相应信号分子或蛋白结合磷酸化，进而激活其下游一系列相关分子，若用抑制剂或药物干预有可能抑制此通路促进肺癌细胞的凋亡[8,10]。张星星等[11]用芪玉三龙汤干预Lewis细胞混悬液皮下种植小鼠建立的荷瘤模型后发现PI3K、AKT蛋白的表达降低，且对荷瘤有明显抑制效果，这可能与调控PI3K/AKT信号通路关键分子有关。补中益气汤[12-13]、补肾疏肝经验方[14]，抑制人肺癌细胞增殖和转移可能与PI3K-AKT信号通路交互作用而发挥了抗癌效果。

中医学认为肺癌的发生与痰、瘀、毒邪侵袭密切相关，笔者总结的经验方-爱康方发挥着清热解毒、消瘀散结的抗癌功效[4]。复方中金荞麦可解肺热之毒，薏苡仁滋养入肺以促排湿毒，通关藤平喘祛痰解毒[15]。资料[16]显示该药也通过PI3K/AKT通路抑制卵巢癌细胞增殖；桃仁、紫珠叶、三七、血余炭及花蕊石共同发挥化瘀止血生新、解毒，臭壳虫散结尤显。前期课题组实验已得出爱康方含药血清诱导小鼠Lewis细胞凋亡的结论，且不同剂量与时间呈一定依赖性，CTX组作为阳性对照，高剂量联合CTX阻滞Lewis细胞于G1期，72 h细胞抑制率高达54.71%，充分表明爱康方可以增强对CTX抑制作用[5-6]。 本实验使用最佳含药[14]血清体外干预小鼠Lewis细胞以观察PI3K、AKT mRNA水平，探讨该方促进小鼠Lewis细胞凋亡是否与PI3K/AKT信号通路作用机制有关。

本实验从反转录水平角度检测小鼠Lewis细胞PI3K、AKT mRNA水平。以空白对照组为参考基准，24 h时各实验组PI3K mRNA水平明显降低，低剂量+CTX组最为明显。48 h时，NS组PI3K mRNA水平高于空白对照组，低剂量、CTX组仅稍低于空白对照组，余实验组PI3K mRNA水平明显降低：中剂量+CTX组>高剂量组>高剂量+CTX组>低剂量+CTX组>中剂量组，其中高剂量组<中剂量+CTX组，中剂量<中、高、低+CTX组，可考虑内部上下碱基探针结合等内部不可避免因素，具体有待进一步探究。48 h中剂量、高剂量、高剂量+CTX组PI3K mRNA水平较24 h降低，48 h低剂量组、CTX组、低剂量+CTX组、中剂量+CTX组PI3K mRNA水平较24 h稍高，说明转录水平可能不随时间点降低。24 h时除低剂量组，各实验组AKT mRNA水平均明显低于空白对照组，48 h各实验组AKT mRNA水平明显降低，且与24 h相比转录水平不随时间降低。说明爱康方不同剂量含药血清可能不随时间依赖性而降低PI3K、AKT mRNA水平，联系PI3K/AKT通路相关研究机制，含药血清刺激细胞膜后激活PI3K，胞内PH结构域与相关靶基因或蛋白结合，继而活化AKT，随时间变化，PH结构域识别有一定特异性，不一定完全使靶基因或靶蛋白磷酸化[17]，再加中药含药血清成分复杂，可能存在多靶点作用，具体仍待进一步探究。爱康方不同剂量及不同剂量联合CTX是从药物浓度依赖性干预Lewis细胞，跨膜刺激作用于PI3K，继而抑制AKT活化，促使细胞凋亡。总体上来讲，实验结果说明爱康方不同剂量及不同剂量联合CTX含药血清作用小鼠Lewis细胞PI3K、AKT基因水平有所降低。

综上所述，爱康方含药血清能降低小鼠Lewis细胞PI3K、AKT mRNA水平，且与CTX协同发挥作用，说明该细胞凋亡作用可能与PI3K/AKT信号通路有关，具体通过该通路哪些作用靶点仍需后续实验进一步验证。