糖皮质激素诱导微血管内皮细胞损伤及凋亡与股骨头坏死的关系*

李凡超 综述，张 飞，彭吾训△审校

(1.贵州医科大学临床医学院，贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院急诊科，贵阳 550004)

糖皮质激素(glucocorticoid,GC)广泛用于治疗各种炎症和自身免疫性疾病，如器官移植、多发性骨髓瘤、肾病综合征和类风湿关节炎等[1]。GC能减轻重症肺炎导致的肺损伤，但大剂量GC增加股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的发生率，且GC是引起非创伤性ONFH的最常见原因[2]。ONFH是一种致残性疾病，如不及时治疗，最终导致股骨头塌陷及髋关节功能障碍，多数需行人工关节置换。GC导致ONFH的发病机制尚不明确，目前已形成多种理论体系，包括脂代谢紊乱理论、炎症与细胞凋亡理论、血管栓塞理论、骨髓间充质干细胞成骨潜能下降理论等[3]。大量证据表明，微循环功能障碍在GC诱导ONFH的发病过程中发挥了关键作用。GC导致局部内皮功能障碍，如血流量减少、内皮细胞凋亡、血栓形成、功能性微血管稀疏等。在ONFH的发生、发展中，骨微血管内皮细胞(bone microvascular endothelial cells,BMECs)损伤及凋亡为中间环节。本文就GC损伤BMECs的机制、BMECs损伤与凝血功能障碍及成骨作用之间的关系进行综述。

1 股骨头BMECs的概述

股骨头由于解剖位置特殊，血管分布少而弱，不易形成侧枝循环，且血管较长及供血范围较大，易引发供血不足和微血栓。骨微血管系统是骨微环境的重要组成部分。骨微血管不仅支持骨内各种细胞的代谢需求，还具有分泌功能。微血管网络丰富，含有众多分支，整体结构类似于珊瑚的形状，毛细血管微动脉与微静脉部分膨大、迂曲、互相缠绕，股骨头软骨血管与软骨下平面呈垂直行走并扩张为血窦，然后转折180°终止于骨静脉，使得终末毛细血管与终末动脉相连。微循环功能障碍会影响新骨形成、骨吸收、营养物质转运和骨微环境的平衡[4]。BMECs贴附于微血管内壁通过连接蛋白相互黏附，呈单层排布，其特点为有窗孔、无隔膜、孔间距较大、内皮基底膜不完整，便于成熟的红细胞穿过[5]。BMECs自身具有分泌功能，分泌的血管分泌素和旁分泌因子调节其稳态和功能[6]，通过细胞旁和细胞外途径调节营养物质和氧气的主动运输。股骨头BMECs的特点[7]有调节细胞膜物质转运及摄取、凝血及纤溶，合成和分泌血管活性物质，参与炎症及免疫反应、血管生成、促进成骨等。

2 GC损伤BMECs的可能机制

BMECs在血管内皮构成中起重要作用，WEINSTEIN等[8]通过GC给药建模，可见骨内血管结构发生水肿。GC引起骨髓水肿导致骨内压增高，破坏血管稳态，进一步影响营养物质和氧气的输送、代谢产物的清除，加重骨坏死。BMECs损伤是股骨头微循环功能障碍的共同环节，GC通过多种途径损伤BMECs，如氧化应激(oxidative stress，OS)、骨内压增高、内质网应激等。

2.1 OS

OS是由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)过量产生，超过抗氧化防御能力，从而导致细胞功能丧失及组织损伤。高OS与各种骨骼疾病的发展有关，包括骨质疏松症、骨肿瘤、类风湿关节炎和强直性脊柱炎[9]。在GC诱导ONFH的基因表达谱中发现OS相关基因Sod3、Cox6a2、Loxl2明显下调[10]。GC会增加BMECs内ROS的浓度，且二者呈正相关[11]。ICHISEKI等[12]在家兔中使用GC后，血中抗氧化酶谷胱甘肽(GSH)明显下降。GC通过多种途径增加ROS的生成，细胞呈高OS状态。OS在BMECs损伤及凋亡的病理生理过程中发挥重要作用[13]。OS可增加内皮细胞的通透性，降低线粒体膜电位，诱导内皮细胞凋亡。NO具有抑制内皮细胞的凋亡、血小板黏附和聚集的作用。大剂量GC增加超氧化物的生成，超氧化物与NO反应形成过氧亚硝酸盐阴离子，使NO丧失生物活性，导致NO生物利用度降低从而促进内皮细胞凋亡。GC诱导OS可能是由于抗氧化酶表达降低而导致的，有实验表明[14]，GC导致细胞保护酶下调和抗氧化水平下降；CHEN等[15]发现，股骨头坏死区域的抗氧化酶发生明显变化，表明坏死区域存在抗氧化水平下降。超氧化物歧化酶通过将超氧自由基还原为不稳定的过氧化氢来实现细胞抗氧化作用，从而保护细胞免受ROS的损害[16]。OS也可通过激活相关通路促进内皮细胞凋亡。OS激活p53通路[17]，促进凋亡相关Bax表达，增加线粒体膜的通透性，促进细胞色素C从线粒体中释放到细胞质，激活Caspase-3，导致BMECs凋亡。

2.2 骨内压增高

GC诱发高血压与外周阻力增强有关。外周阻力增加的原因可能是功能微血管数量减少或毛细血管稀疏[18]。由于使用GC，皮下脂肪动员增加，血脂水平升高，脂质分布异常，脂肪在微血管内栓塞及在髓腔内堆积，髓腔内压力增高，压迫股骨头的微小静脉，导致毛细血管停滞，并抑制毛细血管的生长，骨内压增高及微血管内脂肪栓塞导致BMECs损伤。GC可直接损伤内皮细胞，增强高凝性。BMECs通过产生、释放NO和前列环素I2(PGI2)等血管活性物质，在血管张力的局部调节中发挥作用。6-酮前列环素F1是PGI2的代谢产物，被认为是内皮细胞损伤的标志物[19]。PGI2主要由血管内皮细胞产生，可扩张血管并抑制血小板聚集。HE等[20]在GC诱导的ONFH兔模型中发现，6-酮前列环素F1的水平明显降低，这可能是GC损伤BMECs的一种方式。

2.3 内质网应激

内质网应激可诱导细胞凋亡的发生[21]，激活应激传感器，包括蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、激活转录因子6(ATF6)和需要肌醇的激酶1(IRE1)等，参与细胞稳态的调节。内质网应激是一把双刃剑，内质网通过激活未折叠蛋白反应(UPR)来响应应激。感应到内质网被激活时，PERK齐聚并磷酸化自身，从而间接失活翻译起始因子eIF2α并抑制翻译，PERK有助于减少进入内质网的蛋白流量，缓解内质网应激。然而，强烈或长期的内质网应激会破坏UPR的体内平衡，激活凋亡的内源性和外源性途径，随后，PERK-CHOP信号通路被激活，诱导细胞凋亡[22]。长期使用GC会导致内质网应激，引起内皮细胞的功能障碍和凋亡。GAO等[23]证实在ONFH中GC上调了内质网应激相关蛋白的表达，通过PERK-CHOP信号通路导致微血管损伤和血管内皮细胞凋亡，PERK-CHOP为内质网应激的主要信号通路。

GC损伤BMECs由多因素共同作用引起，具体机制尚不明确。GC导致的BMECs损伤是ONFH病理过程的起始因素，BMECs损伤被认为是启动骨内微循环凝血功能障碍的主要原因。

3 BMECs损伤与凝血功能障碍

血管内皮细胞构成血管壁的内层，在血管稳态中起重要作用。 内皮细胞的完整性是血液在体内维持流动状态的基础。内皮细胞不断暴露在炎性和应激环境中,从而诱导内皮细胞损伤,分泌多种物质调节凝血相关过程。

血小板活化参与GC诱导的ONFH，大剂量GC诱导血小板聚集[24]，内皮细胞凋亡刺激血小板与内皮细胞结合，诱导血小板活化和血栓形成。内皮细胞能产生硫酸肝素及其他肝素样蛋白聚糖，通过黏附抗凝血酶Ⅲ，使凝血酶及Xa失活发挥抗凝作用[25]。内皮细胞分泌各种信号和生物分子，以防止血小板的黏附和聚集。血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)是血管内皮细胞膜表面的一种跨膜蛋白，内皮细胞损伤导致TM水平下降。其主要功能通过内皮细胞调节止血，结合和隔离凝血酶，增加其亲和力来激活C蛋白，使Ⅴa和Ⅷa失活。TM水平的降低是血栓性疾病发展的一个危险因素[26]。PGI2和NO是内皮细胞分泌的主要抗血小板物质，两种物质协同增加血小板中的cAMP水平，从而防止其聚集[27]。MASUHARA等[28]发现血小板活化在GC诱导的ONFH中起着重要作用，在ONFH患者中显示血小板活化明显升高。此外，组织病理学观察发现坏死区域附近的微血管中有血小板血栓形成[29]。血小板活化参与GC诱导的ONFH的进展，可能继发于GC对BMECs的损伤。

内皮细胞可合成并分泌组织纤溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator,t-PA)及纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),使无活性的纤维蛋白溶酶原转化为有活性的纤维蛋白溶酶，从而影响纤溶系统。DENG等[30]研究表明，高剂量地塞米松通过降低t-PA活性和增加PAI-1抗原水平抑制纤溶活性。PAI-1与t-PA形成复合物参与纤维蛋白溶解。GC增加PAI-1的活性，导致低纤溶和相对高凝状态。α-2巨球蛋白(Alpha-2 macroglobulin，A2M)是存在于内皮细胞管腔表面的一种蛋白[31]。在GC诱导ONFH大鼠模型中，A2M基因表达明显上调。A2M涉及止血和儿童血栓栓塞的发展过程，通过抑制纤溶酶和激肽释放酶作为纤维蛋白溶解的抑制剂，并通过抑制凝血酶作为凝血的抑制剂[32]，因此，GC可以通过调节A2M表达改变内皮功能。微颗粒[33](microparticle,MPs)是血管内皮细胞在细胞活化或凋亡过程中释放的小膜泡，具有高水平的促凝活性，MPs有助于ONFH相关的高凝状态和微血管血栓形成。MPs直接诱导内皮细胞功能失调，并激活血栓级联。

大量证据表明[34]，过量GC可引起高脂血症、脂肪在股骨头髓内组织中沉积、脂肪栓塞。这些因素通过骨内压力升高、血流量减少而引起缺血，血脂异常还导致高凝状态，加重缺血，最终导致ONFH。SHAH等[35]发现脂肪栓子诱导骨内纤维蛋白血栓形成，并推测脂肪栓子可能触发血管内凝血，此外，损伤的骨髓脂肪细胞释放出一些血管活性物质。低纤溶和血栓形成在ONFH中起重要作用，如果引起凝血功能异常，可通过抗凝治疗改善。GLUECK等[36]研究了由遗传性血栓形成或低纤溶引起的ONFH患者，在股骨头塌陷前用依诺肝素治疗12周，既能稳定病情发展，又能缓解疼痛。依诺肝素和洛伐他汀联合治疗可降低GC诱导的ONFH在家兔中的发生率[37]。凝血异常和血脂异常在GC诱导的ONFH中起重要作用。但纤维蛋白溶解或血栓形成与ONFH之间的关联尚不清楚，ZHANG等[38]指出血友病与ONFH并没有关联，并认为BMECs损伤是ONFH发生更可能的原因。

BMECs损伤是GC诱导ONFH的中间环节，GC明显影响BMECs的转录组。LI等[39]实验中也显示了高凝剂和低纤溶环境下BMECs的损伤，GC引起的高脂状态也会导致BMECs的损伤。KERACHIAN等[40]指出，BMECs的凋亡可激活血栓级联，引起缺血和梗死。GC通过多条信号通路诱导BMECs凋亡，促进血栓形成[41]。随之而来的是血管问题(血流不畅、血栓形成、缺血缺氧)，血管问题反过来导致内皮细胞损伤，这可能是恶性循环，最终导致ONFH。

4 BMECs损伤与成血管-成骨耦联

骨骼脉管系统在骨骼发育、重塑和体内平衡中起着至关重要的作用。新骨形成和骨折愈合均需要脉管系统的支持，骨修复和骨重塑都涉及血管生成和成骨途径之间的相互作用，微血管与成骨作用最为密切。微血管最重要的组成部分是BMECs，它不仅起着高渗透性屏障的作用，还能分泌成骨调节因子促进成骨细胞及其祖细胞的增殖和分化，启动骨重塑。BMECs损伤必定破坏血管与成骨之间的偶联作用。正常条件下，BMECs保持静止状态。然而当组织损伤或缺氧，BMECs通过高度协调的血管发芽过程形成新血管，血管生成完全由局部血管内皮细胞维持[42]。血管生成包括血管扩张、基膜降解、内皮迁移、趋化、血管通透性增加，最终发生内皮细胞增殖和血管形成。多种生长因子和转录因子控制着血管生成的微调平衡。

血管生成的启动主要是由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)驱动，VEGF是强大的促细胞分裂剂，通过与VEGF受体结合发挥血管生成作用[43]。有研究证实[44]Notch活性在促进血管生成和成骨中起重要作用，DLL4是BMECs中关键的Notch配体，是生长的血管系统中发芽和有丝分裂的强大介质。VEGF与受体激活的血管内皮细胞表达Notch。Notch与配体DLL4整合触发内皮细胞调节Noggin的分泌，Noggin调控骨前体细胞的招募和分化，从而促进骨形成，加速邻近生长板中软骨细胞的肥大和成熟[45]。Notch信号的破坏不仅损害骨血管的形态和生长，而且导致成骨减少，软骨细胞缺损，长骨缩短，小梁骨丢失和骨量减少[46]。此外，VEGF通过激活PI3K和PKB途径来促进内皮细胞存活。药理抑制PI3K或转染Akt突变体可消除VEGF的抗凋亡作用。VEGF也可引起NF-κB配体(RANKL)的上调[47]。RANKL通过PI3K/Akt信号转导途径维持内皮细胞的存活，并强烈刺激血管生成。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一个细胞因子亚群，通常被称为转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)超家族的成员。目前，BMP-2在脉管系统中无处不在，BOULETREAU等[48]在缺氧或VEGF刺激的BMECs中发现，BMP-2 mRNA和蛋白表达增强，直接影响骨重塑。BMP-2可以通过调节骨发育和修复中的一系列细胞过程(包括增殖、分化、迁移、凋亡和黏附)来促进骨矿化基质的形成和骨折再生[49]。BMP诱导成骨是通过上调成骨相关基因 (如Runx2、Osx和Col1a1) 的表达来介导的[50]。当BMECs受损，BMP表达下调，必然影响血管生成和成骨耦合。

缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIF)是细胞适应缺氧的主要调节剂。当BMECs损伤时，局部氧气供应减少。缺氧对红细胞、微血管、促红细胞生成素和VEGF的产生均有一定影响[51]。近年来，已证明缺氧是血管生成与骨形成之间紧密结合的主要驱动力之一。缺氧可以降低HIF不同部位的羟基化，使HIF避免降解和失活，HIF的关键作用是增加VEGF的积累，导致骨血管密度增加，也可调节促红细胞生成素增加Runx2介导的成骨作用，引起骨量增加。然而，血氧含量降低会导致代偿性红细胞增殖，血液黏度增加，血流动力学改变[52]。所有这些变化都会使血液高凝，促进血栓形成，减少有效血管体积，从而加重ONFH。缺氧也可加强GC的作用，通过增加Dkk-1的表达，上调GC受体活性而加重ONFH[53]。OKADA等[54]发现在ONFH患者的股骨头内皮细胞中HIF高表达，在BMECs中转染HIF诱导p21介导的细胞周期阻滞和内皮细胞凋亡。HIF是否有利于血管生成和成骨耦合尚不清楚，需要进一步探索。

骨骼中的血管发育与成骨是相关的，KUSUMBE等[55]确定了在骨骼系统中存在的一种新的毛细血管亚型——H型血管内皮细胞，分泌蛋白Noggin以维持负责骨形成的成骨细胞和软骨细胞；分泌VEGF以支持血管生成，并将血管生成与成骨耦合。H型血管内皮细胞分泌支持血管生成的多种生长因子，调节骨脉管系统的生长，在“成血管-成骨耦联” 过程中发挥重要作用。BMECs损伤及凋亡引起毛细血管再生困难，血管稀疏，骨微血管高凝状态，微血栓形成，导致股骨头微循环功能障碍。骨微循环功能障碍打破二者的耦联过程，中断成骨过程所需的氧气和营养及必要的成骨调节因子，导致成骨能力下降，最终导致ONFH。

5 总结与展望

GC损伤BMECs引起股骨头微循环功能障碍在ONFH的发生、发展中起重要作用。对于ONFH的发病机制，GC一直是人们研究的重点。GC损伤BMECs的机制尚不清楚，但血管损伤是ONFH 病理过程的起始因素逐渐被认可。近年来，随着精准医学的发展及干细胞和分子生物学的研究，上述观点不断得到证实。但BMECs损伤在GC引起的ONFH扮演什么样的角色尚不清楚，从血管与成骨之前耦联作用方面探讨BMECs的作用机制研究甚少。进一步深化对BMECs的了解对于阐明ONFH的病理过程至关重要，这为ONFH的早期治疗提供了一种新的思路和方法，也将成为该领域的研究热点。