自噬在纤维化疾病中的研究进展*

聂 萍,李 虎,朱宏涛,胡建国

(重庆医科大学附属第二医院妇产科,重庆 400010)

纤维化是多种临床疾病的共同病理特征,常引起肺、肝及子宫等器官功能不全,导致临床不良转归。研究表明,纤维化是组织损伤后修复反应失调的结果[1],和正常的伤口愈合反应机制基本相同,涉及多重病理生理反应过程:组织损伤后,成纤维细胞激活并分泌炎症细胞因子,启动伤口愈合反应;修复过程中,结缔组织形成与沉积,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)持续积累,导致组织破坏、器官功能障碍甚至衰竭;炎症原因持续存在时,免疫细胞产生持久的细胞因子和酶,促进肌成纤维细胞活性,上调ECM致纤维化,但其发生、发展的具体调控网络尚不十分清楚。近年来,单细胞基因组学的应用使临床在纤维化组织生物学和疾病机制的探索方面有了新的见解,国内外越来越多的相关研究表明自噬在纤维化中发挥了重要作用,这为发现治疗纤维化的自噬靶点,研究针对性的有效治疗药物提供了重要证据。自噬首次在哺乳动物中被发现,在真核生物中高度保守,是真核生物降解蛋白质的主要途径之一。细胞在饥饿或受到刺激时,通过降解和再循环细胞内长寿胞质蛋白和细胞器等物质,维持细胞稳态的分解代谢过程[2]。根据物质进入溶酶体的途径不同,自噬分为3类,即巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[3]。自噬过程包含自噬的启动、自噬前体的延伸、自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合及物质的降解和再循环5个步骤[4],雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、UNC-51-样激酶1复合物(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG)等关键分子参与其中。目前,临床对自噬的过程有了较为一致的认识,但纤维化中自噬的具体分子机制仍待进一步探索,本本将总结自噬信号通路在纤维化病变中的研究进展。

1 自噬与肺纤维化

肺纤维化与特发性肺纤维化、囊性肺纤维化疾病及硅肺等多种肺部疾病有关。发病过程中,肺泡上皮细胞破坏、成纤维细胞和肌成纤维细胞过度增殖及活化,导致ECM沉积,最终破坏正常肺组织的结构和功能。研究提示,自噬参与多种病因所致的肺纤维化,病因及环境等不同均可对纤维化产生影响,可通过多条信号通路调节上述过程,干预肺纤维化的进展。

自噬活性减弱可促进肺纤维化。成纤维细胞CD148缺失小鼠暴露于博来霉素后,肺间质进一步增厚,增加p-PI3K、p-丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)、p-mTOR、p62的表达,减少LC3-Ⅱ的表达。此外,降低自噬通过增强p62/核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号轴来调节促纤维化基因的表达。该研究表明,CD148缺陷通过调节转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)/PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬,积累p62,并激活NF-κB导致纤维化进展[5]。瘦素处理后增加了A549细胞中α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenase Ⅰ,COL1)和p62的表达,减少LC3的表达,也通过激活PI3K/Akt/mTOR通路参与自噬减弱,促进肺纤维化。上调PI3K/Akt通路可致mTOR激活增加,进而抑制自噬促进肺纤维化。此外,该信号通路还与WNT、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、TGF-β等一同参与肺纤维化的发生、发展[6]。博来霉素暴露小鼠用鞣花酸治疗后,降低了纤维化百分比;博来霉素处理后7/14 d后WNT3a、β-连环蛋白(β-catenin)过表达,鞣花酸抑制了这一过表达效应;进一步实验发现鞣花酸明显降低了氯喹、巴菲霉素A1引起的p62表达增加,提高了WNT3a诱导的自溶体水平,促进了ATG16L1、LC3-Ⅱ及苄氯素1(Beclin1)的表达,Western blot显示实验组细胞中mTOR、核糖体S6(ribosome protein subunit 6,S6RP)磷酸化水平降低。这些结果提示鞣花酸可通过抑制WNT/mTOR信号通路,诱导自噬形成促进纤维化[7]。富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)在人和小鼠纤维化肺及Ⅱ型肺泡上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells,AT2)中明显下调,与对照组比较,实验组p62累积量明显增加,LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化受损,自噬空泡减少,自噬严重受损;Western blot表明LRRK2缺失后细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活性明显下降,提示LRRK2缺失可通过降低ERK、JNK信号通路损伤自噬参与纤维化的进程[8]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是细胞防御应激损伤的重要机制,苏木精-伊红染色发现博来霉素暴露小鼠肺部结构严重损伤,逆转录实时荧光定量PCR、Western blot显示肺纤维化小鼠和肺成纤维细胞中LC3、Beclin1与Nrf2表达下降,Keap1与p62表达增加。研究提示Keap1/Nrf2通路参与自噬过程进而调控纤维化[9]。同样,百草枯诱导的纤维化模型使用Nrf2抑制剂后,肺纤维化的作用影响减弱,表明Nrf2途径参与自噬,减轻百草枯诱导的大鼠肺纤维化[10]。

部分研究表示自噬活性增强可促进肺纤维化。阿奇霉素治疗后降低了成纤维细胞的COL1A1基因表达,阿奇霉素还能明显降低前COL1A1蛋白、α-SMA蛋白和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达,诱导LC3B阳性细胞积累并增加LC3-Ⅱ和p62表达,自噬活性降低,提示抑制自噬可发挥抗肺纤维化作用[11]。高氧损伤肺小鼠中观察到肺间质增厚、肺组织纤维化增多和CX3C基序趋化因子受体1(CX3C motif chemokine receptor 1,CX3CR1)蛋白及mRNA上调。同时暴露于高氧环境的慢-CX3CR1小鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、CD11b表达明显增加,p62表达明显降低,且CX3CR1定位于CD11b阳性细胞,使用Akt抑制剂后逆转了上述改变。研究提示过表达CX3CR1可经Akt通路激活自噬加重纤维化[12]。

2 自噬与肝纤维化

病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及胆汁淤积等各种肝脏慢性疾病可引起肝细胞外基质异常增生和慢性肝损伤,引起肝纤维化,最终导致肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌。自发现大鼠肝脏溶酶体并提出自噬这一概念以来,有关肝脏自噬方面的研究取得了较大进展。研究发现,自噬与肝细胞代谢稳态相关,自噬的紊乱、功能障碍在肝细胞病理改变和肝脏疾病中发挥作用[13],提示自噬可能成为肝纤维化治疗的新方向。肝纤维化的发生、发展过程复杂,涉及通路及细胞群繁多。肝星状细胞是纤维化形成的关键细胞,受刺激后激活成为成纤维性的肌成纤维细胞,迁移到受损部位并分泌促炎、促纤维因子[14],提示自噬涉及肝纤维化作用机制中多条通路。

自噬活性增加可减少肝纤维化发生。小p97/VCP相互作用蛋白(small p97/VCP-interacting protein,SVIP)定位于肝细胞中,饥饿大鼠SVIP表达增加、自噬激活,减轻四氯化碳诱导的肝纤维化,ATG、Beclin1的表达与SVIP过表达呈正相关,推断激活自噬可抑制肝纤维化。姜黄素能减少肝纤维损伤中的纤维结节和恢复肝细胞形态,增加Beclin1、LC3、ATG7蛋白的表达。实验中发现,姜黄素上调腺苷5′-单磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)蛋白和mRNA表达,降低PI3K/Akt/mTOR表达。研究提示,姜黄素激活自噬抗肝纤维化过程可能与AMPK/PI3K/Akt/mTOR信号通路有关[15]。高脂饮食促进非酒精性脂肪性肝病形成,异甜菊醇钠明显减少了肝病面积,改变了肝形态,第10周时COL1、COL3、TGF-β及α-SMA表达恢复到基线水平;进一步发现异甜菊醇钠逆转了沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator factor 2-related enzyme 1,SIRT1)、p-AMPK,表明异甜菊醇钠通过AMPK/SIRT1途径增强自噬调控肝纤维化[16]。

另有研究提示,自噬活性降低可减轻肝纤维化。消退素D1(resolvin D1,RVD1)处理后减少四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维小鼠中肝组织的破坏和胶原增生;使用RVD1后增加了p62的表达,降低了肝纤维小鼠和肝星状细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1水平与多种ATG的mRNA水平;进一步研究提示RVD1增加p-Akt、p-mTOR的表达,Akt、mTOR抑制剂处理后p62水平降低,Beclin1、LC3-Ⅱ水平提高。研究证实RVD1可通过激活Akt/mTOR信号通路来抑制自噬减轻肝纤维化[17]。丙二醇海藻酸钠硫酸钠能减少肝纤维化评分及α-SMA、COL1蛋白和mRNA的表达;对比CCl4和经胆管结扎(bile duct ligation,BDL)组,实验组小鼠和肝星状细胞中Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、信号转导及转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)含量未见明显改变,Beclin1、p-STAT3明显减少,p62明显增加,提示丙二醇海藻酸钠硫酸钠可抑制JAK/STAT通路发挥抗自噬作用,从而减轻肝纤维化[18]。对比BDL、CCl4组,实验中见芹菜素处理组汇管区结构正常化,纤维组织和细胞排列紊乱明显减少;芹菜素逆转了BDL、CCl4组中Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的增加与p62的降低,同时逆转了TGF-β1、Sma和Mad相关蛋白3(Sma-and Mad-related protein 3,Smad3)的激活与p38的磷酸化、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptors α,PPARα)的减少。结果提示芹菜素可通过下调TGF-β1/Smad3和p38/PPARɑ途径抑制自噬与肝纤维化的进展[19]。

3 自噬与肾纤维化

肾纤维化是慢性肾小球肾炎、间质性肾病及糖尿病肾病等多种慢性肾脏疾病终末期的基本病理变化。肾单位损伤后成纤维细胞增生、肌成纤维细胞形成、ECM过度生成沉积,致肾小球硬化、血管硬化和肾小管间质纤维化[20]。损伤状态下的肾脏细胞面临缺氧、氧化应激、内质网应激、线粒体损伤及营养耗竭等多种应激,这些应激均参与自噬的激活[21]。既往研究提示,肾纤维化过程常与肾脏固有细胞自噬相关,但自噬在肾纤维化的不同细胞和疾病中作用不同[22]。随着对自噬相关探究进一步的深入,越来越多的研究证实自噬通过不同通路影响肾纤维化进程。

抑制自噬加速肾纤维化进程。丹酚酸B对器官纤维化有保护作用。加入丹酚酸B后,纤维化大鼠肾组织中LC3B、Beclin1表达上调,p62表达下调,胶原沉积明显减少,提示丹酚酸B可激活自噬减轻肾纤维化[23]。Brahma相关基因1敲除能明显改善单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化,抑制衰老相关蛋白的表达;过表达该基因增加了肾小管上皮细胞中β-catenin的核定位,提高了活性β-catenin及WNT/β-catenin信号转导关键靶基因的蛋白质水平,同时减少了LC3-Ⅱ、Beclin1的表达;ICG-001干预后逆转了上调的COL1、α-SMA等的表达。研究提示,经WNT/β-catenin通路抑制自噬,可诱导肾小管衰老引起肾纤维化发展[24]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可作为糖尿病潜在的治疗靶点,肾纤维化小鼠和细胞模型中其表达均明显下调。高糖处理细胞仅过表达SRY-box转录因子2重叠转录(SRY-box 2 overlapping transcript,SOX2OT),而lncRNA SOX2OT过表达和雷帕霉素预处理会增强LC3荧光强度和纤连蛋白、胶原蛋白表达,上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1水平,减少p62表达,Akt/mTOR活性进一步受抑制,提示lncRNA SOX2OT过表达能通过抑制Akt/mTOR通路促进自噬减轻肾纤维化[25]。

其他研究表明抑制自噬可减轻肾纤维化。衣康酸4-辛酯的实验首次表明,单侧输尿管梗阻和腺嘌呤诱导的纤维化模型在衣康酸4-辛酯处理后可降低p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白及TGF-β表达,上调Smad7蛋白来抑制TGF-β/Smad通路激活,减少TGF-β1诱导细胞中纤维化相关蛋白表达;处理后人肾皮质近曲小管上皮细胞中LC3-Ⅱ水平降低,p62蛋白增加,表明抑制自噬可经TGF-β/Smad通路抑制肾纤维化[26]。

4 自噬与心肌纤维化

心肌纤维化是心肌梗死、心律失常及心肌病等多种心血管疾病的共同病理改变,也是心室重构的重要表现之一。其以多种病理因素影响下心肌成纤维细胞活化为肌成纤维细胞、心脏细胞外基质过度沉积为特征,最终导致心脏收缩和舒张功能障碍[27]。成纤维细胞激活为肌成纤维细胞是心肌纤维化的中心事件[28]。自噬可经多种方式调节心肌细胞重构和物质代谢,是维持细胞稳态的重要过程[29]。

部分研究发现,激活自噬可减轻心肌纤维化。槲皮素相关研究提示[30],心房颤动组miR-223-3p及p62/死骨片1(recombinant sequestosome 1,SQSTM1)表达明显高于窦性心律组,叉头框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)及ATG7、LC3B-Ⅱ表达明显低于窦性组,且miR-223-3p表达与FOXO3表达呈负相关,表明槲皮素调节miR-223-3p靶向激活FOX03促进自噬,进而减轻大鼠心肌纤维化。芪参益气丸与雷帕霉素发挥类似作用[31],实验组大鼠心肌组织病理改变明显减轻,Beclin1、LC3表达增加,p62表达收到抑制,影响自噬;此外,心肌Akt蛋白、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值呈剂量依赖性下降,提示可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路激活心肌自噬,达到抗心肌纤维化的目的。然而,另外有研究发现,抑制自噬可减轻心肌纤维化,应用Calhex可通过抑制自噬-核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyrin结构域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family,pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小体途径,减轻了大鼠心肌梗死后的心肌炎症和纤维化[32]。

5 自噬与胰腺纤维化

胰腺纤维化与多种慢性胰腺疾病的进展密切相关,是慢性胰腺炎、胰腺癌的共同病理学基础。胰腺纤维化形成过程中,胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)、腺泡细胞和巨噬细胞发挥重要作用。其中PSCs是关键细胞,受到理化等因素刺激后自噬活性增加,PSCs由静息态转变为激活态,增殖为成纤维细胞,释放细胞因子产生大量ECM致胰腺纤维化[33-34]。近年来,自噬在胰腺纤维化进程的研究尚不成熟,胰腺纤维化的额发生、发展中是否存在同其他组织纤维化中的相反情况及更多的信号通路有待考证,但自噬在胰腺纤维化发生、发展中确实发挥了重要作用。自噬增强可促进PSCs的激活进而促进胰腺纤维化。体外培养大鼠模型及PSCs中自噬活性增强,同时会检测到α-SMA表达随自噬的增强而增加;3-甲基腺嘌呤处理后可明显降低PSCs中COL1/COL3、FN的表达,证实抑制自噬可阻止PSCs激活,从而达到抗胰腺纤维化作用。PSCs中过表达lnc-PFAR后增加α-SMA、COL1/COL3和FN的表达;结合放线菌素实验并调节lnc-PFAR水平,发现lnc-PFAR通过结合miR-141前体,阻碍miR-141-5p成熟来调节miR-141-5p,进而促进视网膜母细胞瘤线圈蛋白1转录,增加ULK1表达,经ULK1诱导自噬活化进一步激活PSCs并加重胰腺纤维化[35]。柴胡皂苷A处理PSCs后,NLRP3炎性小体减少,ATG5、Beclin1、LC3B蛋白水平呈剂量依赖性降低;与对照组比较,AMPK表达减少,mTOR表达增加,逆转了雷帕霉素预处理所致的mTOR和NLRP3下调并增加了LC3B-Ⅱ。实验表明,柴胡皂苷A通过AMPK/mTOR信号通路抑制PSCs自噬和NLRP3炎症小体,减轻胰腺纤维化[36]。

6 自噬与子宫内膜纤维化

子宫内膜纤维化是宫腔粘连的主要病理学变化。多种病因损伤子宫内膜基底层后造成子宫粘连或闭塞。这些改变最终表现为月经量减少、闭经、不孕及复发性流产等[37],严重影响患者的生理和生殖健康。关于宫腔粘连的发病机制目前仍不明确,但相关文献提示TGF-β、NF-κB、WNT、JAK/STAT等多条信号通路参与其发病过程[38]。上述信号通路作为多种纤维化过程中的关键环节参与自噬,进而调控纤维化,因此,可以推测多种信号通路自噬在子宫内膜纤维化的发展中也有一定作用。

机械损伤所致的宫腔粘连小鼠中,LC3-Ⅱ表达减少,p62表达增加,自噬活性降低,内膜厚度增加,上调自噬活性后,内膜厚度减少,提示自噬活性与宫腔粘连形成有关[39]。研究显示,与对照组比较,表达肾上腺髓质素2的宫内粘连小鼠子宫肥大僵硬,子宫组织中LC3B-Ⅱ降低,COL1A1、p-Akt Ser473、p-核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶表达降低,表明激活音猬因子后通过Akt/mTOR通路调控自噬,参与子宫内膜纤维化的发生[40]。上述内容提示自噬在子宫内膜纤维化进程中可能发挥着重要作用,但目前关于子宫内膜纤维化与自噬的研究较少,该病对女性生理和生殖健康造成极大影响,故积极探究自噬相关领域及机制,具有较大的临床应用价值,可为未来治疗宫腔粘连提供有力的证据。

7 小结与展望

大量研究证实,自噬参与多种器官纤维化病变的发生、发展。自噬在器官纤维化中发挥重要作用,以自噬为靶点来治疗纤维化,能为患者带来新的选择,改善患者预后和生活质量。但是自噬在纤维化中的具体作用仍未十分明确,在肺、肝、肾等器官中,自噬对纤维化的影响都具有两重性,不同器官、不同细胞及不同疾病等均可影响自噬在纤维化中的进展。同时,在肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化研究相对成熟的基础上,有关胰腺纤维化、心肌纤维化和子宫内膜纤维化的研究还相对缺乏,尤其是针对子宫内膜纤维化发病进程中相关机制的研究。