王丽丽，陈达鑫，詹友知，蔡巧燕，庄群川，彭 军
（福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122）
基于基质辅助激光诱导解析-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption-ionization of flighttime mass spectrometry，MALDI-TOF）构成的生物质谱的组织成像技术（mALDI-imaging mass spectrometry，MALDI-IMS）是一门新兴的分子成像技术。与其他成像技术相比，MALDI IMS技术不需要任何分离或纯化的靶分子，不仅能够监测未知的分子，而且可对众多分子的空间分布进行定位。许多研究者证实，MALDI-IMS是一项发展极为迅速的研究方法［1］，可在大范围的组织样品中研究分子种类的分布［2］。MALDI IMS已用于直接探测薄组织切片中的蛋白质、多肽、脂类和小分子类物质的分布［3，4］，已广泛用于疾病进展和相关生物标记物的探测［5-8］。本文利用MALDI-IMS技术对结肠癌组织切片进行了分析，以探讨相关蛋白的变化，为结肠癌相关的研究提供参考。
1 材 料
1.1 材料 导电载玻片（美国布鲁克道尔顿公司）；结肠癌HT-29细胞株购自上海中科院细胞库；SPF级裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。
1.2 试剂 无水乙醇、MTT（西格玛奥德里奇中国分公司）；DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国赛默飞世尔公司）。
1.3 主要仪器 冷冻切片机（德国徕卡有限公司）；真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；扫描仪（台湾Umax Co.）；ImagePrep、MALDI-TOF（美国布鲁克道尔顿公司）。
2 方 法
2.1 细胞培养及动物实验 将市购人结肠癌细胞株HT-29置于含10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPM-1640培养液中，在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞单层贴壁生长，至80%～90%融合时以0.25%胰蛋白酶和EDTA消化传代培养。1.5×106的细胞与基质胶1∶1混合后于无菌条件下种植于裸鼠右侧胸壁第二乳垫脂肪层下，观察肿瘤的生长。待肿瘤中间坏死时，将裸鼠麻醉后取出肿瘤。
2.2 样品的收集和保存 取下的肿瘤组织用PBS将血冲洗干净，用锡箔纸将组织包好在-20℃冷冻30 min后，放于-80℃保存。
2.3 MALDI IMS肿瘤组织冷冻切片后转移到导电的载玻片上，切片用70%乙醇和100%乙醇浸洗。真空干燥后，利用ImagePrep工作站以均匀喷上芥子酸基质（10mg/mL，乙腈∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.2）。
2.4 数据分析 采用FlexImaging 3.0软件进行数据采集后，用ClinProTools 2.2软件进行数据分析。
3 结 果
新鲜的冷冻切片组织按照2.3进行处理后，用扫描仪成像，结果见图1A。实验中对整个组织切片进行质谱分析，并根据组织切片坏死的位置，选取肿瘤正常部位（ROI 1）与肿瘤坏死部位（ROI 2）进行差异分析，见图1。
ROI 1部分的平均质谱图和ROI 2部分的平均质谱图见图2，从图中可以看出：3348Da和6277Da的蛋白差异比较大。3348Da的蛋白在正常肿瘤组织中高于坏死部分；反之，6277Da的蛋白在肿瘤坏死部分高于正常部分。这2种差异蛋白在肿瘤切片组织中的分布见图1B。
4 讨 论
结肠癌（CRC）是世界上最常见的胃肠道肿瘤，其发病率和死亡率在全部恶性肿瘤中排第3位［9］。结肠癌5a生存率虽明显增高，但确诊时在伴有远处转移的患者中，5a生存率仅有8%［10］。癌症能否得到有效地治疗及治愈取决于是否能够在癌症早期阶段对其进行及时地检测。生物标志物作为最直接快速有效的诊断手段，其筛选与获得可在肿瘤诊断、发展、治疗以及疗效监测等多个方面发挥重要的作用，因此成为研究的热点及重点。由于MALDI IMS技术不需要事先知道靶分子的信息，不仅能够监测未知的分子，而且可对众多分子的空间分布进行定位，因此为快速获得及筛选生物标志物带来了极大的可能。
图1 肿瘤切片的扫描图（A）和MALDI IMS图（B）
图2 肿瘤正常部位（ROI 1）和肿瘤坏死部位（ROI 2）质谱图
本文采用部分坏死的结肠癌组织切片作为研究对象，从肿瘤正常部位（ROI 1）和肿瘤坏死部位（ROI 2）质谱图（图2）比较中，可以看出3348Da和6277Da 2种蛋白在肿瘤正常部位和坏死部位差异比较大。图1B显示了这2种差异蛋白的空间分布，从图中可以看出：3348Da的蛋白主要分布在正常肿瘤组织中，而6277Da的蛋白主要分布在肿瘤坏死的部位。因此，MALDI IMS结果显示6277Da的蛋白可以作为结肠癌肿瘤组织坏死的生物标志物。
［1］KOIZUMI S，YAMAMOTO S，HAYASAKA T，etal.Imaging mass spectrometry revealed the production of lyso-phosphatidylcholine in the injured ischemic rat brain［J］.neuroscience，2010，168（1）：219-225.
［2］SETOU M，SHRIVAS K，SROYRAYA M，etal.Developmentsandapplications of mass microscopy［J］.Medical molecular morphology，2010，43（1）：1-5.
［3］杨帆，原剑，郑俊杰，等.MALDI—TOF生物质谱成像技术的进展［J］.分析仪器，2010（3）：1-8.
［4］SHIMMA S，SUGIURA Y，HAYASAKA T，etal.MALDI-based imaging mass spectrometry revealedabnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis［J］.Journal of Chromatography B，2007，855（1）：98-103.
［5］GIBLIN M F，SIECKMAN G L，SHELTON T D，etal.In vitroand in vivo evaluation of 177Lu-and 90Y-labeled E.coli heatstable enterotoxin for specific targeting of uroguanylin receptors on human colon cancers［J］.Nuclear Medicineand Biology，2006，33（4）：481-488.
［6］PEVSNER P H，MELAMED J，REMSEN T，etal.Mass spectrometry MALDI imaging of colon cancer biomarkers：a new diagnostic paradigm［J］.Biomarkers，2009，3（1）：55-69.
［7］MEDING S，BALLUFF B，ELSNER M，etal.Tissue-based proteomics reveals FXYD3，S100A11and GSTM3as novel markers for regional lymph node metastasis in colon cancer［J］.The Journal of Pathology，2012，228（4）：459-470.
［8］ELSNER M，RAUSER S，MAIER S，etal.MALDI imaging mass spectrometry reveals COX7A2，TAGLN2and S100-A10as novel prognostic markers in Barrett'sadenocarcinoma［J］.Journal of Proteomics，2012，75（15）：4693-4704.
［9］SIEGEL R，NAISHADHAM D，JEMAL A.Cancer statistics，2013［J］.CA：A Cancer Journal for Clinicians，2013，63（1）：11-30.
［10］COMELLA P，CASARETTI R，AVALLONE A，etal.Optimizing the management of metastatic colorectal cancer［J］.Critical Reviews in Oncology/Hematology，2010，75（1）：15-26.
