冉添福，刘小倩，杨 绘，江 澍
（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）
中医学对自然流产（spontaneous abortion，SA）的研究源远流长，从《金匮要略》到《诸病源候论》，再到《景岳全书·妇人规》等，均对此病有所记载［1］。现代医学认为，SA的定义是在妊娠28周前，未使用人工方法而发生的妊娠终止［2］。SA的病因除了生殖道异常、胎儿染色体异常、免疫因素及感染因素外，内分泌异常特别是性激素水平的改变也被认为是SA的常见病因［3］。正常的妊娠过程不仅需要发育良好的子宫环境，也需要各种激素相互协调共同促进胚胎发育生长。在妊娠期间，内分泌的异常会导致诸多妊娠相关疾病，例如黄体功能不全、高泌乳素血症、多囊卵巢综合征等［4］。本课题组前期研究发现泰山磐石散能够提高孕激素的表达水平，从而起到抑制免疫和抗炎的作用，达到降低流产发生率的目的［5］。本研究在前期研究基础上，进一步探讨泰山磐石散在治疗自然流产时黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、泌乳素（prolactin，PRL）、睾酮（testosterone，T）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）等性激素对妊娠的影响作用。
1 实验材料
1.1 实验动物 SPF级10周龄雄性SD大鼠15只，9周龄雌性SD大鼠15只，体质量（240±20）g，购于福建中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2019-0002。饲养于福建中医药大学SPF级实验动物中心，自由饮水摄食，温度（24±2）℃，湿度为40%～60%，每天12 h明暗环境交替。
1.2 实验药物 溴隐亭（福州博涵生物公司），取2.5 mg溴隐亭溶于75%乙醇，配制成浓度为0.3 mg/mL的溴隐亭混悬液，4℃避光保存，1周以内使用。泰山磐石散药物组成：人参9 g，黄芪9 g，白术4.5 g，炙甘草4.5 g，当归9 g，川芎7.2 g，白芍7.2 g，熟地黄7.2 g，川续断9 g，黄芩9 g，砂仁4.5 g，糯米18 g，购自福建中医药大学附属人民医院。将所有药物混合（除砂仁外），加入适量纯水，浸泡1 h，将砂仁研磨成粉末备用，大火煮沸，然后文火再煮25 min，加入砂仁粉末继续煎煮5 min，过滤2次得药液；在药渣中再加入适量纯水，重复以上操作1次；将2次药液混合，浓缩至120 mL，制成含生药量1 g/mL的药液，4℃保存。
1.3 实验试剂和仪器 LH、PRL、T、FSH的ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；酶标仪（澳大利亚GmbH公司）；电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；水平离心机（上海安亭科学仪器厂）；恒温水浴锅（苏州净化设备有限公司）；超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组 将SD大鼠适应性喂养14 d，期间对雌性SD大鼠进行数次称重，观察体质量是否达到配种标准，待雌鼠体质量达到配种要求后，将15只雌鼠和15只雄鼠按1∶1比例合笼过夜配种，并将15只雌鼠随机分为正常对照组、模型组、泰山磐石散组各5只，配种后次日开始，每日7时观察雌性大鼠排泄物中有无阴道栓脱落。当观察到雌鼠有阴道栓脱落时视为妊娠第1天，并分别每天记录孕鼠体质量。
2.2 干预 正常对照组孕鼠从受孕第1天至取材前1天（共12 d）灌服生理盐水，从受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射75%乙醇溶液，连续注射3 d；模型组孕鼠从受孕第1天至取材前1天（共12 d）灌服生理盐水，从受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射溴隐亭，连续注射3 d；泰山磐石散组孕鼠从受孕第1天至取材前1天（共12 d）按2.49 g/（kg·d）予泰山磐石散药液灌胃，从受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射溴隐亭，连续注射3 d。
2.3 取材 于大鼠妊娠的第12天取材（禁食不禁水12 h），进行称重，腹腔注射8%的乳化异氟烷（0.51～0.64 mL/kg）麻醉孕鼠，待孕鼠完全麻醉后，迅速解剖，打开腹腔，观察妊娠情况，取腹主动脉采集外周血，外周血室温静置2～3 h，待血液凝固血块收缩后，4℃下12 000 r/min离心10 min，取上清，分装，置于-80℃冰箱中保存。
2.4 ELISA法检测大鼠血清中LH、PRL、T、FSH的表达 将4℃存放的试剂盒放置室温平衡30 min，严格按照说明书提示进行操作，于15 min内按照说明书的要求，在酶标仪选择合适的波长测量各孔的吸光度（OD值）。以标准的浓度作为横坐标，测出的OD值作为纵坐标，作出标准曲线，计算样品浓度。
2.5 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件对实验数据进行分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组内比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。方差齐采LSD法分析，方差不齐采用Games-Howell法分析；不符合正态性检验者，采用非参数分析。
3 结果
3.1 3组大鼠血清中LH、PRL、T、FSH表达水平比较 与正常对照组比较，模型组孕鼠血清中LH、PRL、T和FSH浓度均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，泰山磐石散组孕鼠血清中LH、T和FSH浓度明显降低（P＜0.05），见表1。
表1 3组大鼠血清中LH、PRL、T、FSH浓度比较（±s）
表1 3组大鼠血清中LH、PRL、T、FSH浓度比较（±s）
注：与正常对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。
组别正常对照组模型组泰山磐石散组n555 LH/（ng/L）47.86±2.66 56.85±2.631）49.57±3.082）PRL/（pg/mL）167.31±10.01 214.33±8.741）214.15±9.001）T/（nmol/L）84.44±3.77 102.88±5.791）95.33±5.952）FSH/（IU/L）26.58±1.39 30.60±1.001）28.04±1.422）
3.2 3组大鼠胚胎情况比较 与正常对照组比较，模型组大鼠子宫内瘀血严重，胚胎颜色呈黑紫色，部分胚胎体积明显减小，胚胎吸收率明显增高（P＜0.05）；与模型组比较，泰山磐石散组大鼠子宫内状态明显好转，接近于正常对照组大鼠，胚胎呈淡粉色或红色，胚胎吸收率明显降低（P＜0.05），见图1、表2。
表2 3组大鼠胚胎吸收率比较（±s）
表2 3组大鼠胚胎吸收率比较（±s）
注：与正常对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。
组别正常对照组模型组泰山磐石散组n 555胚胎总数/个107 92 98胚胎吸收数/个9 31 19吸收率/%8.29±0.03 35.23±0.091）19.31±0.032）
图1 3组大鼠胚胎妊娠情况
4 讨论
自然流产是一个极其复杂的疾病，甚至可以称之为疑难杂症，对女性及其家庭的伤害是巨大且无可挽回的，其致病原因众多［6］，且半数以上的病因仍无法明确。内分泌异常是SA的常见病因，内分泌特别是性激素水平对胚胎发育的影响是巨大的，内分泌异常最终会导致妊娠失败［7］，所以在孕前检查通常会检测性激素水平，可检测是否存在黄体功能不全、高泌乳素血症和多囊卵巢综合征等情况，本实验通过检测流产模型孕鼠血清中的部分性激素（LH、PRL、T、FSH），探究泰山磐石散在治疗SA过程中对性激素的调控作用。
LH又称为促黄体生成素，是由垂体前叶分泌的激素，能够刺激卵巢分泌雌激素，并对睾酮的分泌有促进和刺激作用。一般在女性的月经期，体内的LH浓度会呈上升趋势，在某一点到达高峰后迅速下降。LH过高会引起一系列妊娠相关疾病，例如原发性性功能减退症、卵巢功能衰竭等，严重的就会导致不孕或妊娠失败［8］，但黄体生成素增多导致流产的作用机制一直未能明确，有相关报道称可能是因为改变了卵泡的生存环境从而造成卵母细胞早熟有关［9］。本研究发现用溴隐亭所造大鼠流产模型的LH值升高，使用中药泰山磐石散可降低孕鼠体内LH，最终改善大鼠妊娠状态，发挥良好的安胎作用。
PRL又称为催乳素，由垂体前叶腺嗜酸性细胞分泌，有促进乳腺发育生长和泌乳的作用，还可刺激卵泡LH受体生成。有研究表明，小剂量的PRL对卵巢激素与孕激素的合成有促进作用，而大剂量的PRL则会产生抑制作用，从而使受精和胚胎发育受阻，最终导致不孕和妊娠失败［10-11］。本实验证明大鼠流产模型体内的PRL含量显着升高，而泰山磐石散可以降低泌乳素的表达水平，妊娠结局良好。
T除了由睾丸分泌还可以由肾上腺皮质和卵巢合成，女性释放在血中的睾酮主要来自于肾上腺皮质。正常情况下，女性体内的睾酮和雌激素水平是保持平衡的，如果雄激素过多，则容易导致高雄激素血症，该病主要在卵巢和肾上腺发生，主要特点是多毛、不孕、多囊卵巢综合征和卵巢肿瘤等，有研究显示约1/5的流产患者患有高雄激素血症［12］，高雄激素作为雌激素的拮抗剂，会通过作用于卵母细胞，导致卵泡发育障碍，最终引发不孕和流产［13］。女性体内过多的雄激素会抑制下丘脑分泌促性腺激素释放激素，影响子宫内膜的增生，并影响胚胎的着床或发育［14］。本次实验进一步研究证明大鼠流产模型体内的睾酮水平明显升高，使用泰山磐石散可以降低睾酮的表达水平，更好地维持妊娠，使胚胎能够正常着床、发育。
FSH以糖蛋白为主要成分，作用主要为促进卵泡成熟，主要由垂体前叶嗜碱性细胞分泌。对于女性而言，LH联合FSH对卵泡成熟，生成雌激素、排卵，黄体的产生与维持，孕激素的生成均有促进作用［15］。妊娠期间，随着卵泡的发育，雌激素分泌增加，加上抑制素的作用，卵泡生长对FSH的依赖性降低，故FSH水平也随之降低［8］。本实验研究证明大鼠流产模型体内的FSH水平相比正常对照组升高，使用泰山磐石散可以降低FSH的表达水平，改善流产情况。
综上所述，泰山磐石散主要通过降低母体血清中LH、T、FSH等性激素的表达水平，改善了母体的内分泌水平，从而保证了胎儿的正常发育，最终达到降低流产风险，改善妊娠结局的作用。但在研究泰山磐石散对流产模型大鼠血清中PRL表达的影响中发现：模型组大鼠血清中PRL的表达与正常组比较明显升高（P＜0.05），但与泰山磐石散组差异无统计学意义（P＞0.05）。因此本实验后续拟增加样本量，并用其他实验方法继续探讨泰山磐石散对流产模型大鼠血清中PRL的影响。
