熏硫苦杏仁药材的脱硫工艺研究

郑莹 刘鹏

（中国医科大学附属第一医院药学部，辽宁 沈阳 110001）

中药材为防止虫蛀、霉变和改善外观［1］，常使用硫磺熏蒸工艺漂白和延长保存期限［2］。但研究文献表明，经硫磺熏蒸后中药材表面会残留有二氧化硫，对人体有潜在的毒副作用［3］，在熏蒸过程中也可能会造成中药材的化学成分改变，影响药效［4］。硫磺性温味酸有小毒，能助阳益火，用于类似功效的配方中有协同作用，反之会起反作用。因此，一直有科研工作者在进行熏硫药材的脱硫研究［5-7］。2015版《中国药典》中规定山药、葛根等10味中药材及饮片中二氧化硫残留量不得超过400 mg/kg，其他药材不得超过150 mg/kg［8］。苦杏仁的主要功效是降气、止咳、平喘和润肠通便，与硫磺的药效不相关。苦杏仁是种子类药材，硫磺熏蒸后二氧化硫主要富集在种子表面，种子表面紧实程度高，与其他中药饮片相比，较易去除。根据前期研究结果，碳酸氢钠溶液具有较强的吸收二氧化硫的能力，本文参照文献建立了离子色谱法测定二氧化硫残留量［9-10］，用碳酸氢钠溶液作为脱硫液，超声波辅助脱除二氧化硫。正交设计可在单因素试验的基础上获得优化的工艺方案［11-12］，本研究通过单因素考察结合正交试验设计优化脱硫工艺，建立熏硫苦杏仁药材的脱硫方法。在使用前先脱硫来减少对二氧化硫的摄入，为苦杏仁药材的安全使用提供参考。

1 仪器与方法

1.1 仪器 数控超声波清洗器（KQ3200DE型，昆山市超声仪器有限公司）；离子色谱仪（ICS-90型，美国戴安公司）；高效液相色谱仪（1200型，美国Agilent公司）；电子分析天平（XS205DU型，瑞士梅特勒公司）；试验筛（新乡市同心机械责任有限公司）。

1.2 原料与试药 硫酸根标准溶液（1000 mg/L，中国计量科学研究院，批号：GBW（E）080266）；苦杏仁苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110820-201004，纯度94%），苦杏仁药材（沈阳同仁堂（亳州）饮品有限公司，批号20180216），乙腈为色谱纯，其他试剂和水均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 熏硫苦杏仁药材中二氧化硫残留量的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Dionex Ionpac AS11A阴离子色谱柱；流速1.0 mL/min；柱温30℃；流动相：10 mmol/L KOH溶液；进样量20 μL。

2.1.2 熏硫样品的制备 购买的苦杏仁药材经检测未用硫磺熏制，把苦杏仁药材平铺置于通风橱内的架子上，将硫磺点燃放在通风橱内，关闭通风橱密封24 h，制备熏硫苦杏仁药材，依法制备3份自制熏硫苦杏仁样品（20180505、20180506和 20180512）。

2.1.3 供试品溶液的制备 样品粉碎过二号筛制成粗粉，精密称取10 g置于水蒸汽蒸馏装置中，样品瓶中加入50 mL水和5 mL盐酸，立即密封进行水蒸汽蒸馏。用20 mL 3%H2O2作为接收液，至接收瓶中液体接近100 mL时，停止蒸馏，用纯化水定容至刻度。样品液以0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，以离子色谱仪测定其中的硫酸根离子含量，再换算出二氧化硫含量。

2.1.4 系统适用性试验 依据2.1.1项下条件分析，结果见图1。样品中二氧化硫以硫酸根离子形式检出，其他成分对测定无干扰，理论塔板数按硫酸根离子计大于2000，硫酸根离子与相邻峰间分离度大于1.5，保留时间约7.96 min。熏硫苦杏仁样品中硫酸根离子的离子色谱图见图1（C）。

图1 空白液（A）、硫酸根离子标准品溶液（B）、熏硫苦杏仁（C）和未熏硫苦杏仁（D）的离子色谱图

2.1.5 线性范围和检出限 采用外标法定量，将硫酸根离子标准品溶液稀释成浓度为1.0、5.0、10.0、25.0和50.0 mg/L的标准品溶液，经离子色谱仪分析，测定硫酸根离子色谱峰面积，以峰面积A为纵坐标，质量浓度C（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线方程。标准曲线方程为A=0.0.0893C-0.0410，相关系数为0.9999，硫酸根离子在1.0~50.0 mg/L线性关系良好。

将稀释后3倍噪音时的硫酸根离子标准品溶液浓度为方法检测限，以10倍噪音时的浓度为方法定量限，结果硫酸根离子的检测限和定量限分别为0.08 mg/L和0.33 mg/L，换算成二氧化硫的检测限和定量限分别为0.05 mg/L和0.22 mg/L。

2.1.6 精密度和重复性试验 取5.0 mg/L的硫酸根离子标准品溶液，按色谱条件分析，重复进样6次，测定峰面积计算精密度，RSD%为2.45%。取熏硫苦杏仁药材（20180505）6份，制备供试品溶液，分析计算硫酸根离子含量，RSD为4.18%，表明方法的精密度和重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 将制备好的样品供试液，分别在1、2、4、8、12和24 h进样，记录峰面积。结果峰面积RSD为3.39%，表明供试液均在24 h内稳定性良好。

2.1.8 回收率试验 精密称取苦杏仁样品粗粉10 g，分别加入无水亚硫酸钠溶液（相当于二氧化硫浓度为216 mg/L）1.0、2.0和4.0 mL，制备3个浓度的样品，每个浓度制备3份样品，依法制备供试液离子色谱分析，计算回收率。结果，苦杏仁样品在0.22、0.43和0.86 mg 3个水平的加标回收率在96.30%~102.08%，RSD小于5.0%，回收率测试结果见表1。

表1 苦杏仁中二氧化硫残留量测定的加标回收率结果

2.1.9 样品含量测定对3份自制熏硫苦杏仁样品（20180505、20180506和20180512）进行测定，结果二氧化硫残留量为（64.37±1.88）mg/kg、（61.07±0.79）mg/kg和 （57.30±0.94）mg/kg，符合中国药典的要求。

2.2 熏硫苦杏仁药材中苦杏仁苷的测定 参照2015年版《中华人民共和国药典》一部苦杏仁药材的含量测定法［8］测定熏硫苦杏仁中的苦杏仁苷含量。色谱条件为：以乙腈-0.1%冰醋酸（8∶92（v/v））为流动相，用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色谱柱，流速 1.0 mL·min-1，柱温40℃，检测波长210 nm，进样量20 μL。苦杏仁苷色谱峰约在12.8 min出峰，在本条件下，其他成分对苦杏仁苷的测定无干扰，理论塔板数按苦杏仁苷计＞3000。经测定3批熏硫苦杏仁（20180505、20180506和20180512）苦杏仁苷含量分别为（4.85±0.24）%、（4.88±0.07）%和（4.75±0.36）%。

2.3 单因素考察结合正交试验优化熏硫苦杏仁药材的脱硫工艺

2.3.1 熏硫苦杏仁药材的脱硫方法 取熏硫苦杏仁药材30 g，按照液料比（mL/g）加入适量5%NaHCO3溶液，用所需超声波频率处理至指定超声时间，取出用纯化水冲洗干净后放入烘箱40℃烘干。再粉碎过二号筛制成粗粉，按照2.1和2.2项下方法测定其中的二氧化硫残留量和苦杏仁苷含量。

2.3.2 单因素试验 以脱硫后药材中二氧化硫残留量和苦杏仁苷的含量为考察指标，根据预实验结果，选择液料比（A）、超声波时间（B）和超声波功率（C）3个因素进行单因素试验，确定试验范围，见表2~3。苦杏仁苷类化合物是苦杏仁药材的药效成分，以损失率不高于5%的目标，确定各因素的3个水平依次为：液料比5∶1、10∶1、15∶1（mL/g），超声波功率 90、120、135 W，提取时间3、5、10 min。

表2 单因素试验的因素与水平

表3 单因素试验结果

2.3.3 正交试验设计 通过单因素试验，以液料比（A）、超声波时间（B）和超声波功率（C）为考察因素，以脱硫后样品中二氧化硫残留量和苦杏仁苷含量的综合评分为考察指标［综合评分=（100-脱硫后二氧化硫残留量/原熏硫药材中二氧化硫残留量）×0.5+（脱硫后苦杏仁苷含量/原熏硫药材中苦杏仁苷含量）×0.5］。采用L9（34）正交试验筛选优化处方，正交实验设计及结果见表4，正交设计试验的因素与水平见表5，方差分析结果见表6。

表4 正交试验设计与结果

表5 正交试验的因素与水平

表6 正交试验结果方差分析表

由正交试验结果可见，各因素对二氧化硫的脱除影响顺序为C>B>A，即超声波功率对脱硫效果的影响最大，方差分析表明各因素对二氧化硫的脱除的影响无统计学意义，根据以上结果，最优化的搭配为A3B2C3，即按照液料比10∶1（mL/g）加入5%NaCO3溶液，用超声波处理时间5 min（超声波功率135 W），处理后取出用纯化水洗净即可。

2.3.4 验证试验 按照正交试验优化的脱硫工艺，脱除熏硫苦杏仁药材（20180505）中的二氧化硫，进行验证试验，制备三份脱硫苦杏仁样品，测定分析其中二氧化硫残留量和苦杏仁苷含量，结果见表7。即通过脱硫工艺脱除了药材中82.13%的二氧化硫，药材中苦杏仁苷损失率为2.97%。

表7 验证试验结果

3 讨论

中药材熏硫加工法费用低、效果好，是中药材产地的常用加工方法。已证实残留的二氧化硫会改变药材的成分和影响药效的发挥，最好去除后使用。苦杏仁药材表面结构致密，与其他药材相比，较易去除附着在表面的二氧化硫。本研究用单因素考察结合正交设计优化了熏硫苦杏仁药材的脱硫工艺，验证试验表明效果良好。本法可脱除80%以上的二氧化硫残留，同时苦杏仁苷损失率不超过5%。

超声波处理可以加快附着在药材表面的二氧化硫的溶出速度，也会导致苦杏仁中的苦杏仁苷类化合物的损失。本研究对苦杏仁药材不经粉碎直接超声处理，可避免种子内部苦杏仁苷的流失。用本法处理，苦杏仁苷的损失远低于二氧化硫脱除率。因此，用本法处理熏硫苦杏仁药材再使用，利大于弊。在本研究中，用超声波处理苦杏仁药材超过10 min，苦杏仁苷的损失率显着升高，这可能是超声波将苦杏仁种子震碎产生裂隙后内部成分开始溶出的原因，为了保证药效，用本法超声波处理不宜时间过长。与文献报道相比，本法脱硫效果较好，脱硫率较高，这也可能是由于本文所用熏硫药材为自制品，未经过长时间的储存和放置所致，本法对市售熏硫苦杏仁的脱除情况需要采集大量样本后得出。

综上所述，本文建立的离子色谱法分析苦杏仁药材中的二氧化硫残留量，方法稳定可靠、重现型好，适用于苦杏仁药材的二氧化硫残留量控制。优化所得的脱硫工艺稳定可行，可为熏硫苦杏仁药材的安全使用提供参考。