弓 强 黄浩楹 陈乐乐 柴 智 樊慧杰
（山西中医药大学基础医学院，山西 晋中 030619）
百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloidesBge.）主要分布于山西、河北及山东等地，是多年生草本植物，春、秋二季采挖，以干燥根茎入药。中药材知母的药用历史有2000年之久，历代本草古籍均有记载。知母味甘、苦，性寒，有清热泻火、滋阴润燥之功效，是常用的清热泻火类中药［1］。现代药理研究认为知母具有解热［2，3］、降血糖［4］、改善认知缺陷［5］、抗炎和免疫调节［6］等方面的作用。
石竹科植物石竹（Dianthus chinensisL.）主要分布于河北、河南、辽宁及江苏等地，是多年生草本植物，夏、秋二季花果期采割，以干燥地上部分入药称为瞿麦（Dianthus superbusLinn.）。瞿麦最早记载于《神农本草经》，被列为中品，药用历史悠久。瞿麦味苦，性寒，归心、小肠经，属于利水渗湿类中药，有利尿通淋、活血通经之功效，临床用于热淋、血淋、石淋和小便不通等方面的治疗［7］。现代药理研究认为，瞿麦具有抗肿瘤［8，9］和潜在治疗吉兰-巴雷综合征［10］的作用。
目前，知母和石竹均未有深入到基因组学的研究，而基因组学研究的首要前提是测定基因组大小。基因组大小是指生物单倍体细胞的DNA含量（又称C值）。本实验欲采用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）测定知母和石竹的基因组大小，为基因组学研究提供重要数据。
1 材料与方法
1.1 实验材料知母和石竹是待测植物，采自山西中医药大学校园中草药种植基地；蒙古黄芪是测定的内标植物，采自山西中医药大学校园中草药种植基地。将三种植株的幼嫩叶片作为细胞核的提取材料。
1.2 实验仪器、试剂和耗材流式细胞仪BD Accuri C6 PLUS 购自美国BD 公司。试剂Triton X-100（批号D220BA0041）、 四 盐 酸 精 胺（ 批 号512BA0029）、Na2EDTA（批号D328BA0007）购自BBI生命科学有限公司。试 剂NaCl （批 号D710BA0034）、KCl （批 号D316BA0025）购自生工生物工程上海股份有限公司。β-巯基乙醇（批号D124BA0001）购自美国Sigma-Aldrich 股份有限公司。碘化丙啶（PI）（批号326C042 8）、核糖核酸酶A（RNase）（批号20170607）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（批号0922S0714）、400 目尼龙筛网（批号20161111）购自北京索莱宝生物科技有限公司。
1.3 FCM测定知母和石竹基因组大小的方法
1.3.1 制备裂解液LB01裂解液LB01：15 mmol/L Tris，2 mmol/L Na2EDTA，0.5 mmol/L 四盐酸精胺，80 mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，0.1%Triton X-100，15 mmol/L β-巯基乙醇；调pH至7.5。
1.3.2 制备细胞核滤液分别采集知母、石竹、蒙古黄芪、知母和蒙古黄芪等质量混合、石竹和蒙古黄芪等质量混合的幼嫩叶片，每份20 mg。蒸馏水清洗叶片，滤纸吸净表面水分。置叶片于玻璃培养皿中，加入预冷LB01解离液1 mL。锋利刀片迅速垂直切碎叶片，混匀，冰上静置培养皿5 min。尼龙筛网过滤，收获细胞核滤液［11］，依次加入1 mg/L 的RNase 20 μL、1 mg/L 的PI 20 μL，置于4 ℃冰箱染色5 min。
1.3.3 FCM 检测轻摇流式管分散细胞核，上流式细胞仪检测，低速抽取5000 个PI 染色的细胞核。选用波长488 nm 的蓝光激发荧光PI，藻红蛋白（PE）通道收集荧光强度的数据和图像。变异系数（Coefficient of variation，CV）＜5%，表明数据可信［12］。数据和图像用流式细胞仪软件分析，将数据代入基因组大小的计算公式，待测植物基因组大小=待测植物荧光强度的均值/内标蒙古黄芪荧光强度的均值×内标蒙古黄芪基因组大小（蒙古黄芪基因组大小为1.46 Gb）［13，14］。
2 结果与分析
知母、石竹、蒙古黄芪分别用FCM 检测，单独检测结果见图1。据此可见知母和石竹的出峰位置均与蒙古黄芪的出峰位置不同，可以保证蒙古黄芪作为测定内标时，实验的可行性与结果的准确性。
图1 单独样品的FCM检测结果
知母和内标蒙古黄芪混合样品的FCM 检测结果见图2 和表1。据此可见散点图中有两团集中的粒子团，峰图中两峰独立、峰形佳，知母和蒙古黄芪的CV 均小于5%，各数据可信，进而可知知母的荧光强度均值为287 888.33，蒙古黄芪的荧光强度均值为167 845.33，将各均值代入计算公式中，得到知母的基因组大小为2.50 Gb。
表1 知母基因组大小的测定结果
图2 知母和内标蒙古黄芪混合样品的FCM检测结果
石竹和内标蒙古黄芪混合样品的FCM检测结果见图3和表2。据此可见散点图中有两团界限清晰的粒子团，峰图中两峰不重叠、峰形佳，石竹和蒙古黄芪的CV都小于5%，各数据可信，进而可知石竹的荧光强度均值为101 071.33，蒙古黄芪的荧光强度均值为159 980.67，将各均值代入计算公式中，得到石竹的基因组大小为0.92 Gb。
表2 石竹基因组大小的测定结果
图3 石竹和内标蒙古黄芪混合样品的FCM检测结果
3 讨论
FCM 是测定植物基因组大小的首选方法，在测定时需要选用一个已知基因组大小的植物作为标准品。具体应用标准品测定基因组大小的方法有两种：一种为外标法；另一种为内标法。外标法是分别单独上机测定待测物和标准品的荧光强度，内标法是待测物中加入标准品以混合样品上机检测荧光强度。虽然外标法较为简便，但是一般采用内标法测定待测物的基因组大小，因为内标法可以保证混合之后的操作过程和环境一样，能在相同的条件下测定待测物，减少了实验误差，结果更为准确［15］。但是内标法需要注意筛选合适的内标，以避免待测物的峰位和内标的峰位出现重叠现象。
前期预实验中，选用大豆Williams 82 为知母和石竹基因组大小测定的共同内标，研究发现石竹的峰位与大豆Williams 82 的荧光峰位出现重叠，区分度不佳，初步推测石竹的基因组大小与大豆Williams 82的1.11 Gb的数值接近。蒙古黄芪已在前期的实验中测定出其基因组大小为1.46 Gb［14］，并且由于本实验室蒙古黄芪的数量充足、细胞核提取方便，所以选定蒙古黄芪作为知母和石竹基因组大小测定的共同内标。本研究发现内标蒙古黄芪有效避免了与待测物知母和石竹荧光信号的重叠，知母 的CV 值 为4.82%～4.98%，石 竹 的CV 值 为3.96%～4.49%，蒙古黄芪的CV值亦未超过5%，故蒙古黄芪适合作为知母和石竹的内标植物，保证基因组大小测定的可行性和准确性。进而测定出知母的基因组大小为2.50 Gb；石竹的基因组大小为0.92 Gb。知母、石竹与内标蒙古黄芪，三者基因组大小的关系是：石竹＜蒙古黄芪＜知母。基因组大小在很大程度上是恒定不变的，是生物的一个基本特征。基因组大小是物种基因组测序中的一项重要的研究内容。本研究不仅可以为其他植物基因组大小的测定提供借鉴；而且可以促进知母和石竹的基因组资源开发，有助于深入认识知母和石竹。
