张华敏，刘娜，邓巧娟
（广东医科大学附属医院，广东 湛江 524000）
非酒精性脂肪性肝病（non alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除病毒或酒精等因素引起的肝损伤，国内目前有超过1.5亿患者，其中20%~40%患者发展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）[1-2]。细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，目前已有研究表明细胞焦亡在NASH的发展中起着至关重要的作用[3-4]。
羟基红花黄色素A是一种单查尔酮类化合物，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎症、抗血小板凝集等活性。LI Y N[5]等研究表明羟基红花黄色素A对于肝纤维化有一定的疗效。HE Y[6]等研究表明羟基红花黄色素A对大鼠酒精性肝损伤具有保护作用。本研究采用游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）处理L-02细胞建立NASH细胞模型，在此基础上观察和测定羟基红花黄色素A对NASH的影响，并探寻其作用机制是否与肝细胞细胞焦亡有关，从而为NASH的临床治疗研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 细胞L-02细胞系购于中科院上海细胞库，将细胞解冻后离心，加入DMEM培养基，于37℃，5%CO2条件下培养。
1.2 药物与试剂 羟基红花黄色素A（上海士锋生物科技有限公司，货号：78281-02-4，纯度≥98%）；DMEM（美国Gibco公司，货号：12100046）；胎牛血清（美国Gibco公司，货号：16000044）；油红O染色液（上海生工，货号：E607319-0010）；油酸（上海生工，货号：A502071-0250）；棕榈酸（上海纯优生物，货号：P0687）；一步法反转录荧光定量试剂盒（上海生工，货号：B639277-0050）；Trizol（上海生工，货号：B610409-0025）；炎症小体感受器分子NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）兔单克隆抗体（艾博抗公司，货号：M00034）；半胱氨酸蛋白酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）兔单克隆抗体（艾博抗公司，货号：ab207802）；消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）兔单克隆抗体（艾博抗公司，货号：ab209875）；白细胞介素-18（IL-18）兔多克隆抗体（艾博抗公司，货号：ab207324）；白细胞介素-1β（IL-1β）兔多克隆抗体（英国abcam，货号：ab9722）；磷酸甘油脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗体（英国abcam，货号：ab9485）；HRP标记二抗（英国abcam，货号：ab30451）。
1.3 主要仪器HERAcell150i型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；51029702型超净台（Thermofisher公司）；680型酶标仪（Bio-Rad公司）；CFX96型PCR仪（Bio-Rad公司）；PowerPac Basic型电泳仪（Bio-Rad公司）；AlphaImager HP型凝胶成像系统（美国阿尔法公司）。
1.4 分组与给药 将油酸或棕榈酸溶解于无水乙醇中，制备为50 mmol/L的储存液。羟基红花黄色素A溶解于DMEM培养基，浓度为500 mg/L。实验分为对照组、模型组和羟基红花黄色素A组，对照组为不做处理的人正常肝脏细胞L-02，模型组用500μmol/L的FFA（油酸∶棕榈酸=2∶1）处理L-02细胞24 h，羟基红花黄色素A组在模型组基础上用0.2 mg/mL的羟基红花黄色素A处理细胞24 h，羟基红花黄色素A处理时间和方法参考文献[5]。
1.5 油红O染色检测各组细胞中的脂质沉积 将油红O工作液加入各组细胞中，室温孵育60 min，弃染色液，用PBS清洗后，显微镜下观察拍照。
1.6 ELISA检测各组细胞内ALT、AST、SOD、MDA、IL-18、IL-1β含量 收集各组细胞，2 500 r/min离心20 min，收集上清备用。按照各自ELISA检测试剂盒说明书检测细胞内谷丙转移酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、IL-18、IL-1β含量。
1.7 RT-qPCR检测细胞中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表达水平 收集各组细胞，分别加入TRIzol提取RNA，再参照一步法反转录荧光定量试剂盒检测NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表达水平，以GAPDH为内参。RT-qPCR反应程序见说明书。引物如下，NLRP3正向：5'-GCGCCTCAGTTAGAGGATGT-3'，反向：5'-ACCAGCTACAA AAAGCATGGA-3'；Caspase-1正向：5'-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3'，反向：5'-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3'。GSDMD正向5'-CCATCGGCCTTTGAGAAAGTG-3'，反向：5'-ACACATGAATAACGGGGTTTCC-3'；GAPDH正向：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向：5'-GGGGTCATT GATGGCAACAATA-3'。
1.8 Western blotting检测各组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达 收集各组细胞，分别加入RIPA裂解液，冰上放置20 min后，4℃13 000 r/min离心20 min，取35μg总蛋白进行SDS-PAGE，转PVDF膜，用2%BSA封闭液封闭，分别加入一抗（1∶1 000）4℃过夜，以GAPDH抗体（1∶10 000）为参照，再加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝胶成像系统分析结果。
1.9 统计学方法 数据均采用SPSS 21.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料用（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较均采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 油红O染色结果 对照组细胞内未出现红色脂滴，模型组细胞红色脂滴较多，细胞肿胀，细胞间隙变大；与模型组比较，羟基红花黄色素A组红色脂滴减少，细胞肿胀得到改善。（见图1）
图1 油红O染色结果图（×400）
2.2 羟基红花黄色素A抑制NASH炎症反应及氧化应激 与对照组比较，模型组IL-18、IL-1β、MDA明显升高（P＜0.05），SOD明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，羟基红花黄色素A组IL-18、IL-1β、MDA明显下降（P＜0.05），SOD明显升高（P＜0.05），提示羟基红花黄色素A能够改善NASH炎症反应和氧化应激。（见图2~3）
图2 各组细胞炎症因子含量比较（±s，n=3）
图3 各组细胞MDA、SOD含量比较（±s，n=3）
2.3 羟基红花黄色素A改善NASH肝细胞损伤 与对照组比较，模型组AST、ALT含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，羟基红花黄色素A组AST、ALT含量明显下降（P＜0.05），提示羟基红花黄色素A能够改善肝细胞损伤。（见图4）
图4 各组细胞ALT、AST含量比较（±s，n=3）
2.4 羟基红花黄色素A抑制NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、GSDMD mRNA的表达 与对照组比较，模型组NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，羟基红花黄色素A组NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表达水平明显下降（P＜0.05）。（见图5）
图5 各组细胞NLRP3 mRNA、GSDMD mRNA、Caspase-1 mRNA表达水平比较（±s，n=3）
2.5 羟基红花黄色素A抑制NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表达 与对照组比较，模型组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，羟基红花黄色素A组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表达明显下降（P＜0.05）。（见图6）
图6 各组细胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表达比较（±s，n=3）
3 讨 论
随着对NASH发病机制研究的深入，目前越来越多研究表明炎症反应是NASH的主要诱导因素，而肝脏脂质过氧化导致的氧化应激也会加重对肝脏的损伤[7-9]。IL-1β和IL-18是炎症因子，在NASH发展中加重肝脏炎症反应；SOD具有抗氧化的作用，而MDA是脂质过氧化产物，二者分别代表着抗氧化能力和氧化损伤程度；ALT和AST反映肝功能损伤程度，当肝细胞受损时，ALT和AST会呈升高状态[10-11]。李风林等[12]发现非酒精性脂肪肝病大鼠血清IL-1β、IL-18含量较对照组明显升高。杨素贞等[13]对NASH模型大鼠及正常大鼠血清ALT、AST、肝组织中MDA和SOD进行检测，发现模型组大鼠ALT、AST、MDA含量明显升高，SOD含量明显下降。羟基红花黄色素A具有单查尔酮苷类结构，是红花黄色素的有效成分。近几年已有研究表明，羟基红花黄色素A可通过抑制活性氧的生成，调节SOD和MDA的活性来缓解氧化应激[14]。此外，羟基红花黄色素A能抑制炎性细胞因子IL-1β，TNF-α的表达[15-16]。因此，推测羟基红花黄色素A抑制NASH的发生发展可能与抑制氧化应激反应和炎症反应有关。为了验证推测，本研究采用FFA处理L-02建立NASH细胞模型，经羟基红花黄色素A处理后，L-02细胞的氧化应激和炎症水平明显降低，且AST、ALT含量明显下降，这与推测结论一致。此外，羟基红花黄色素A处理细胞的剂量0.2 mg/mL是经过参考文献及前期MTT预实验筛选确定的，羟基红花黄色素A在0~0.2 mg/mL的范围内细胞存活率较高，为非细胞毒性剂量。
细胞焦亡是一种依赖于Caspase的炎性细胞死亡形式，伴随着细胞肿胀，质膜孔洞形成，调控大量促炎性细胞内容物释放[17]。目前已有研究表明肝脏库普弗细胞、中性粒细胞、树突状细胞和肝细胞都能发生焦亡参与NASH发生机制的调节[18]。NLRP3属于Nod样受体家族，由凋亡相关斑点样蛋白、核苷酸结合寡聚化结构域及半胱氨酸蛋白酶1前体蛋白3部分组成，其通过激活并裂解pro caspase-1来调控成熟IL-1β和IL-18的释放，诱导细胞焦亡，进而扩大炎症反应[19]。目前已有研究表明敲除NASH模型小鼠肝组织NLRP3基因后可抑制炎性反应，缓解脂肪变性和肝炎病情[20]。GSDMD基因定位于人染色体8q24，因具有质膜成孔活性成为Caspase-1和Caspase-11介导的细胞焦亡的主要执行者。YANG Y[21]等研究表明激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡信号通路可以促进人类子宫内膜癌细胞焦亡。本研究结果显示模型组细胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β均被激活，说明NASH介导了细胞焦亡，而经羟基红花黄色素A处理后，L-02细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β表达水平明显降低，这与MRIDHA A R等[20]的研究和XU B[22]等的研究结果相似，提示羟基红花黄色素A可以抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡信号通路激活。
综上所述，羟基红花黄色素A可减轻L-02细胞的炎症反应和氧化应激水平，抑制肝细胞焦亡，从而改善NASH肝细胞损伤，可能与其抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡信号通路的激活有关。然而羟基红花黄色素A通过何种途径抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡信号通路有待进一步研究。
