刘雨昕，王国华
（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029）
子宫腺肌病（adenomyosis，ADS）是子宫内膜腺体及间质侵入子宫肌层，伴周围肌层细胞的代偿性肥大和增生的一种良性病变[1]。ADS的发生与发展和子宫平滑肌的异常收缩有密切关系[2]。研究发现，ADS患者的病灶局部存在子宫内膜与肌层交界区（endometrial-myometrial interface，EMI）的微损伤，为修复组织的微损伤，病灶局部的高雌激素状态无法解除，子宫蠕动增强，反复损伤EMI，周围组织微创伤和子宫内膜内陷不断加重，最终导致ADS的侵袭性进展，这一机制即ADS的组织损伤与修复机制（tissue injury and repair，TIAR）。而在TIAR过程中关键的RhoA/ROCK信号通路是一种钙离子（Ca2+）非依赖性的平滑肌收缩调节机制，这一机制通过Rho家族中的RhoA基因激活下游的Rho相关激酶（Rho-associated kinase，ROCK）和磷酸化肌球蛋白轻链（phosphorylated myosin light chain，p-MLC），对ADS的细胞形态学有重要影响，并在ADS发生发展的多种生物学过程如细胞收缩、黏附和增殖中均发挥重要作用[3]。已有研究证实，ADS患者中医证候共同特点为存在“瘀血”[4-5]，而应用具有活血化瘀功效[6]的桂枝茯苓丸治疗ADS可有效改善患者疼痛症状，降低血清癌抗原125（cancer antigen-125，CA-125）水平，降低异位子宫内膜细胞的侵袭力，调节ADS病灶局部基质金属蛋白酶-2（matrix metallopeptidase 2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-7（matrix metallopeptidase 7，MMP-7）蛋白表达水平[7]，但其药效物质基础尚不明确。本研究将桂枝茯苓丸应用于美国癌症研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠ADS模型，以明确桂枝茯苓丸对模型小鼠RhoA/ROCK信号通路相关分子的影响，从而为桂枝茯苓丸的药效物质基础提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 实验动物90只健康的无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级雌性ICR小鼠，鼠龄1日龄（设小鼠出生日为1日龄），体质量1.8～2.4 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。小鼠饲养于SPF级动物饲养室，饲养温度18～24℃，相对湿度40%～60%，每天光照12 h，小鼠1～21日龄均由母鼠哺乳喂养，22日龄起与母鼠分笼，自由摄食饮水。实验开始前母鼠适应性喂养1周。实验结束时所有小鼠以丙泊芬（10 mg/kg）尾静脉麻醉后，取材处死。本研究全部内容遵循《世界医学协会郝尔辛基宣言》，所有小鼠均接受人道护理及处死方式。
1.2 药物与试剂 桂枝茯苓丸颗粒剂由桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮共5味中药各等量配伍（北京中医药大学第三附属医院药剂科，批号：20190905）；苏木精（批号：20190324）、伊红（批号：20190328）；总RNA提取试剂盒（批号：20200108）、反转录试剂盒（批号：202000203）（北京天根生化科技有限公司）；RhoA、ROCK1、ROCK2荧光定量PCR试剂盒（美国西格玛奥德里奇公司，批号：20200224）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）荧光定量PCR试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20200201）；兔抗鼠p-MLC多克隆抗体（批号：20200121）、兔抗β肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批号：20200121）（上海艾博抗贸易有限公司）；RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA引物序列（北京缔威乐生物科技有限公司，批号：20200227）。
1.3 主要仪器WTB 200型电子天平（波兰瑞戈威公司）；85-2恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；EG1160型石蜡包埋机（德国莱卡公司）；KM2135型石蜡切片机（德国莱卡公司）；DP71数码相机（日本奥林巴斯公司）；BX51型光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；QuantStudio 5型定量PCR仪（美国赛默飞世尔科技公司）；DYY-2C型SDS-PAGE电泳仪（北京六一仪器厂）；1-15K型冷冻高速离心机（美国西格玛奥德里奇公司）。
1.4 造模与分组 经文献检索，尚未发现作用于RhoA/ROCK信号通路治疗ADS的良好对照药物，故不设立阳性对照组，仅设立生理盐水灌胃作空白对照组。通过随机数字表法，将90只雌性小鼠随机分为空白对照组，模型组，桂枝茯苓丸高、中、低剂量组，每组18只。除空白对照组外，其余小鼠依照参考文献[8]，采用滴喂他莫昔芬法建立ICR小鼠ADS模型，于小鼠出生后第2～5天，滴喂5μL/g体积比为2∶0.2∶3的炼乳/卵磷脂/花生油混合液+2.7μmol/kg他莫昔芬，1次/d。空白对照组小鼠于出生后第2～5天，每天滴喂5μL/g的生理盐水。于小鼠49日龄，各组以随机数字表法随机选取2只小鼠，以丙泊芬（10 mg/kg）尾静脉麻醉处死，取部分子宫组织置于4%多聚甲醛中固定48 h备用。对子宫组织逐级酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡并包埋，蜡块5μm厚度连续切片，以苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色并封片，在配有数码相机的光学显微镜下观察子宫肌层内膜组织浸润情况并拍照，见空白对照组小鼠子宫肌层形态完整，未见明显腺体或间质浸润；模型组和桂枝茯苓丸高、中、低剂量组小鼠子宫肌层内有大量子宫内膜腺体及间质浸润，并伴有部分腺体肿胀、子宫内膜增生。提示小鼠ADS造模成功。（见图1）
图1 ICR小鼠子宫HE染色（×100）
1.5 实验给药 分别取一定量的桂枝茯苓丸颗粒剂，用生理盐水配制成高、中、低剂量桂枝茯苓丸溶液，磁力搅拌器50℃搅拌10 min后灌胃。于小鼠50日龄起，每日10:00:00，桂枝茯苓丸高、中、低剂量组小鼠分别灌胃给予高、中、低剂量[8.64、4.32、2.16 g生药/（kg·d）]的桂枝茯苓丸溶液，空白对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，5μL/g；1次/d，共灌胃30 d。
1.6 观察指标 于各组小鼠灌胃结束后1 d，每组以随机数字表法随机选取12只小鼠，称体质量并记录，以丙泊芬（10 mg/kg）尾静脉麻醉处死，取子宫组织共12份，其中6份置于4%多聚甲醛中固定48 h备用，另6份液氮冻存备用。
1.6.1 小鼠子宫组织HE染色 组织切片及HE染色步骤同“1.4”。切片染色结果以双盲法由两名副主任医师职称以上的病理医师判定，于高倍镜下选择2个视野的组织部位，按照小鼠子宫组织内膜腺体及间质浸润程度分为4度。0度：无明显浸润，肌层形态完整；1度：轻度浸润，间质或上皮细胞浸润至内膜基底层界面下，未超过浅肌层内1/2；2度：中度浸润，间质及上皮细胞浸润至浅肌层外1/2；3度：重度浸润，间质及上皮细胞浸润至深肌层或浆膜下。
1.6.2 实时荧光定量PCR（qPCR）检测小鼠子宫组织RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA的表达 采用总RNA提取试剂进行样本RNA提取，把小鼠子宫组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后，实验操作按产品说明书进行。反转录采用博友顺反转录试剂盒方法，10×g DNA Eraser Buffer 1μL，gDNA Eraser 0.5μL，RNA Template 300 ng，RNase-Free Water 10μL，42℃温浴5 min去除基因组DNA，200 U/μL HiFiScript 1μL，Oligo-dT Primer 1μL，5×ScriptRT Buffer 4μL，RNase-Free Water 4μL，42℃温浴20 min，85℃温浴5 min进行逆转录反应。采用qPCR法检测RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA的表达，反应体系为10μL：2×SG Green qPCR Mix 5μL，Forward Primer（10μmol/L）0.2μL，Reverse Primer（10μmol/L）0.2μL，cDNA 1μL，Water（nuclease-free）3.6μL。按照试剂盒说明书混合均匀，离心，分到96孔PCR板里，每个样品每个基因3个PCR平行反应。PCR反应参数设置：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，反应进行共40个循环。溶解曲线绘制：95℃15 s，60℃60 s，85℃15 s，60℃15 s。采用2-△△ct方法分析数据。引物设计由NCBI-Nucleotide基因库检索后，使用Primer Premier 5.0软件进行设计。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.6.3 Western blotting检测小鼠子宫组织磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）表达 取小鼠子宫组织置于缓冲液中，低温匀浆后离心提取小鼠子宫总蛋白，Loary法蛋白定量。8%SDS聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶中电泳2 h，转膜至甲醛预处理过的聚偏氟乙烯（PVDF）膜，牛奶封闭2 h，加入兔抗鼠p-MLC、兔抗β-actin标准内参一抗（1∶2 000），4℃孵育过夜；Tris Buffered Saline with Tween（TBST）缓冲液洗膜40 min后，加入二抗（1∶10 000），孵育1 h，TBST洗膜40 min，显色压片后使用Image J软件分析条带的光密度值，每个条带重复测量3次。p-MLC的相对表达=p-MLC光密度值/内参β-actin光密度值。
1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料均以“均数±标准差”（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，检验方差齐性，若方差齐性，则进一步采用Bonferroni法行两两比较；等级资料比较采用Kruska-Wallis H秩和检验，若Kruska-Wallis H秩和检验呈现出显着性（P〈0.05），进一步采用Nemenyi法检验进行两两比较。P〈0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组小鼠样本脱落情况 实验过程中共有9只小鼠死亡。动物模型的建立过程中，空白对照组死亡1只，模型组死亡2只，桂枝茯苓丸中剂量组死亡2只，桂枝茯苓丸低剂量组死亡1只；灌胃给药过程中，桂枝茯苓丸高剂量组死亡2只，桂枝茯苓丸中剂量组死亡1只。取材时桂枝茯苓丸中剂量组小鼠样本量最少，为12只小鼠，为平衡组间样本量，其余各组小鼠均取按随机数字表法随机取12只小鼠处死取材作指标观察。各组取材的12只小鼠中，6只行HE染色，6只行实时荧光定量PCR及蛋白印迹检测。
2.2 各组小鼠子宫组织病理学改变情况 空白对照组小鼠子宫肌层形态完整，无明显内膜腺体浸润；模型组小鼠子宫肌层中的异位子宫内膜腺体及间质浸润程度较深，间质及上皮细胞浸润至深肌层或浆膜下；桂枝茯苓丸高、中剂量组小鼠子宫肌层中的异位子宫内膜腺体及间质浸润位于深肌层至浅肌层之间；桂枝茯苓丸低剂量组小鼠子宫肌层中的异位子宫内膜腺体及间质浸润程度较模型组轻，间质及上皮细胞浸润至浅肌层外。（见图2）
图2 各组小鼠子宫组织病理图（HE，×100）
5组小鼠子宫内膜润程度分级比较，差异有统计学意义（H=23.257，P〈0.01）。模型组小鼠子宫内膜浸润程度分级明显高于空白对照组（P〈0.01）；桂枝茯苓丸高、中剂量组小鼠子宫内膜浸润程度分级明显高于空白对照组（P〈0.05）；桂枝茯苓丸低剂量组小鼠子宫内膜浸润程度分级与空白对照组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；桂枝茯苓丸高、中、低剂量组小鼠子宫内膜浸润程度分级与模型组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；桂枝茯苓丸高、中剂量组小鼠子宫内膜浸润程度分级与桂枝茯苓丸低剂量组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见表2）
表2 各组小鼠子宫肌层子宫内膜腺体及间质浸润程度分级比较（只）
2.3 各组小鼠子宫组织RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相对表达量比较 模型组小鼠子宫组织中RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相对表达量明显高于空白对照组（P〈0.01或P〈0.05），ROCK2 mRNA相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；桂枝茯苓丸低、高剂量组小鼠子宫组织中RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相对表达量明显低于模型组（P〈0.01或P〈0.05），ROCK2 mRNA相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；桂枝茯苓丸中剂量组小鼠子宫组织中RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相对表达量与模型组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）；桂枝茯苓丸高剂量组小鼠子宫组织中RhoA mRNA、ROCK2 mRNA相对表达量明显低于桂枝茯苓丸低剂量组（P〈0.01）。（见表3）
表3 各组小鼠子宫组织RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相对表达量比较（±s）
表3 各组小鼠子宫组织RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、ROCK2 mRNA相对表达量比较（±s）
注：与空白对照组比较，aP〈0.05，bP〈0.01；与模型组比较，cP〈0.05，dP〈0.01；与桂枝茯苓丸高剂量组比较，eP〈0.05，fP〈0.01
组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）RhoA mRNA ROCK1 mRNA ROCK2 mRNA空白对照组 6 - 0.018 2±0.019 4 0.003 6±0.003 2 0.020 8±0.010 6模型组 6 - 0.041 0±0.033 4a 0.006 3±0.004 4a 0.028 0±0.011 2桂枝茯苓丸高剂量组6 8.64 0.007 0±0.006 7ad 0.002 4±0.002 0d 0.014 1±0.005 2a桂枝茯苓丸中剂量组6 4.32 0.033 9±0.035 6f 0.006 3±0.005 8e 0.026 6±0.140 3桂枝茯苓丸低剂量组6 2.16 0.020 0±0.010 3cf 0.003 3±0.002 3c 0.020 9±0.006 9f
2.4 各组小鼠子宫组织p-MLC蛋白相对表达量比较 模型组小鼠子宫组织中p-MLC蛋白相对表达量明显高于空白对照组（P〈0.05）；桂枝茯苓丸高、低剂量组小鼠子宫组织中p-MLC蛋白相对表达量明显低于模型组（P〈0.01或P〈0.05）；桂枝茯苓丸低剂量组小鼠子宫组织中p-MLC蛋白相对表达量高于桂枝茯苓丸高剂量组（P〈0.05）；桂枝茯苓丸中剂量组小鼠子宫组织中p-MLC蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）。（见图3、表4）
图3 各组小鼠子宫组织p-MLC蛋白表达图谱
表4 各组小鼠子宫组织p-MLC蛋白相对表达量比较（±s）
表4 各组小鼠子宫组织p-MLC蛋白相对表达量比较（±s）
注：与空白对照组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05，cP〈0.01；与桂枝茯苓丸高剂量组比较，dP〈0.05
组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）给药p-MLC空白对照组 6 - 0.852 5±0.068 5模型组 6 - 1.091 2±0.063 7a桂枝茯苓丸高剂量组6 8.64 0.600 9±0.128 1c桂枝茯苓丸中剂量组6 4.32 0.877 8±0.119 2d桂枝茯苓丸低剂量组6 2.16 0.813 8±0.076 5bd
3 讨 论
西医将ADS的治疗归属于妇科子宫内膜异位性疾病范畴，认为ADS发病机制较为复杂，且部分患者在疾病初期难以明确诊断而无法得到早期干预。ADS的主要症状为逐渐加重的进行性痛经，伴有月经量增多、经期延长，更与不孕密切相关[9]。相关研究表明，ADS可降低育龄女性的生育能力，增加妊娠妇女发生流产、早产、胎膜早破等不良产科结局的概率[10]，严重影响患者的身心健康与生活质量。因此，对于ADS的发病机制和治疗方法的研究受到了人们的广泛关注。
在ADS发病机制的相关研究中，子宫内膜肌层交界区（endometrial-myometrial interface，EMI）作为子宫特有的解剖学结构，在ADS的发病中起到重要作用。EMI由子宫内1/3肌层与子宫基底层内膜构成，是阻止子宫内膜侵入生长于子宫肌层的关键结构。研究发现，存在宫腔手术操作史的女性ADS发病率为无宫腔手术操作史的女性的1.5倍[11]，诊断性刮宫、人工流产、剖宫产、放置宫内节育器等手术操作会引起EMI损伤，进而导致EMI局部雌激素浓度升高，以促进子宫内膜的增殖与修复。然而，EMI局部的高雌激素状态会激活RhoA/ROCK信号通路。RhoA/ROCK信号通路是一种Ca2+非依赖性的平滑肌收缩调节机制，在细胞形态学、细胞收缩、黏附和增殖等多种生物学过程中发挥着重要作用[3]，与子宫平滑肌的异常收缩有密切关系。RhoA基因通过介导下游的ROCK1蛋白信号分子，增加效应分子磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）的表达，从而激活肌球蛋白头部Mg2+-ATP酶，通过ATP的水解产生能量，进而使肌球蛋白与肌动蛋白相互作用，引发平滑肌收缩，子宫蠕动增强，EMI反复损伤，周围组织微创伤和子宫内膜内陷不断加重，局部高雌激素状态无法解除，ADS的TIAR机制启动，最终导致ADS的侵袭性进展。本研究结果显示，模型组小鼠子宫组织内膜浸润程度分级，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相对表达量及RhoA/ROCK信号通路下游效应分子p-MLC的蛋白表达量均高于空白对照组（P〈0.05）。而桂枝茯苓丸低剂量组小鼠子宫组织内膜浸润程度分级，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相对表达量及p-MLC的蛋白表达量与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。这与现有的针对子宫腺肌病RhoA/ROCK信号通路的相关研究结果一致[1-3]，验证了RhoA/ROCK信号通路在ADS的发病与进展中起到了重要作用，且其发挥效应主要通过上调ROCK1基因的表达，而与ROCK2基因无关[12]。
中医学中无ADS病名，但根据ADS症状可将其归属于“症瘕”“痛经”“月经过多”“经期延长”等范畴。本病病位在下焦胞中，基本病机为瘀血阻滞冲任、胞宫[13]，病因多为感受外邪、情志内伤或手术损伤等因素导致脏腑功能失常、气血失和、冲任失调，经血不循常道，留于下腹而为瘀[14-15]。古代医家认为气滞瘀血不化，发为症瘕为本病的基本病机，如《景岳全书·妇人规》：“瘀血留滞作症，惟妇人有之，然血必由气，气行则血行。”[16]这也与现代医家对本病的病机认识相吻合。针对子宫腺肌病患者的中医证候与体质分布情况的相关研究显示，子宫腺肌病患者中医证候共同特点为存在“瘀血”，而其中医体质以“气郁质”为主[5]。韩竹林[17]应用聚类分析方法对ADS的中医证型进行分析显示，ADS证型中血瘀证最多，占70.59%。可见，ADS的核心病机为“瘀血内停”。本研究使用的桂枝茯苓丸源自《金匮要略》的经典名方，相关原文论述为：“妇人宿有症病，经断未及三月，而得漏下不止，胎动在脐上者，为症痼害。”[18]提出应用桂枝茯苓丸以治疗症瘕。桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮共5味药各等量研末，炼蜜为丸而成，其中桂枝味辛、甘，性温，温通经脉而行瘀血；素有症瘕，血瘀日久多化热，故配伍味苦，性微寒的牡丹皮、赤芍，与辛温之桂枝相辅相成，可在清热活血的同时使本方性味更为平和；桃仁味苦、甘，性平，配伍前药增强活血祛瘀之效；茯苓味甘、淡，性平，渗利下行而益心脾之气，既有助于行瘀血，又防行血太过伤正；上药又以白蜜和丸，取缓和诸药逐瘀药力之意，使本方可长期服用，以达到活血化瘀、缓消症块之功。桂枝茯苓丸中、高剂量组小鼠子宫组织内膜浸润程度分级明显高于空白对照组（P〈0.05），但与模型组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；桂枝茯苓丸低剂量组小鼠子宫组织内膜浸润程度分级与空白对照组，差异无统计学意义（P〉0.05）。与现有关于桂枝茯苓丸对ADS疗效的相关研究结果相符[19]，验证了桂枝茯苓丸对ICR小鼠子宫腺肌病有治疗作用。
综上所述，桂枝茯苓丸对ICR小鼠子宫腺肌病的治疗作用确切。本研究结果显示，桂枝茯苓丸低剂量组小鼠子宫组织RhoAmRNA、ROCK1mRNA相对表达量及p-MLC蛋白相对表达量明显高于模型组（P〈0.05）；而桂枝茯苓丸低剂量组小鼠子宫组织内膜浸润程度、RhoAmRNA、ROCK1mRNA相对表达量、p-MLC蛋白相对表达量与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。桂枝茯苓丸高剂量组小鼠子宫组织中RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达、p-MLC的蛋白表达量均低于空白对照组比较（P〈0.05或P〈0.01），而子宫内膜浸润程度分级高于空白对照组（P〈0.05），表明RhoA/ROCK信号通路的正常表达，从而介导下游肌动蛋白的正常表达，是阻止ADS内陷内膜侵袭，从而治疗ADS的关键[13]。适宜剂量的桂枝茯苓丸可能通过将RhoA/ROCK信号通路相关分子的表达调节至正常水平，从而在ICR小鼠子宫腺肌病的治疗中发挥作用；而剂量过高的桂枝茯苓丸反而会抑制RhoA/ROCK信号通路表达，降低其治疗ADS的效果。但需要注意的是，本研究并未对ADS小鼠RhoA/ROCK信号通路进行阻断以对照处理，且目前尚无已明确作用于RhoA/ROCK信号通路治疗ADS的药物可供作阳性对照，实验结论仍有局限性，还应在未来增加应用RhoA/ROCK信号通路阻断剂的对照组、扩大样本量等，进一步探讨桂枝茯苓丸治疗ADS的药效物质基础。
