夏士涛，王培宇，张开创，魏 静

（黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

慢性硬膜下血肿（chronic subdural hematomas，CSDH）常见于老年群体。随着老龄化社会结构的发展，接受介入手术的老年患者日益增加，抗凝药物、抗血小板药物的广泛应用导致CSDH发病率逐年上升[1]。近年来研究发现[2-3]，CSDH血肿吸收速度与血肿包膜血管新生具有紧密联系，而血管内皮细胞生长因子（vascularendoth elial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等血管生成相关因子与该病预后同样密切相关。海风藤是胡椒科植物风藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤茎，具有通经络、祛风湿的功效，主要用于风寒湿痹、筋脉拘挛、屈伸不利的治疗。有报道显示[4]，海风藤提取物可通过减轻氧化应激、减少神经元凋亡改善脑缺血再灌注损伤大鼠脑损伤，提示其具有神经功能保护作用。但目前有关海风藤醇提取物对CSDH治疗作用的研究尚少。本研究通过建立CSDH大鼠模型，观察海风藤醇提取物对血管新生及VEGF、bFGF表达的影响，以期为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄SPF级雄性Wistar大鼠60只，体质量（370±20）g，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2020-0007。所有大鼠健康状态良好，实验前于动物房适应性饲养7 d，温度（24±1）℃，相对湿度（55±5）%，12 h/12 h明暗交替。本研究经实验动物管理委员会批准。

1.2 药物与试剂 海风藤醇提取物（批号：1073-06-9，纯度＞98%）购自西安青芷生物技术有限公司，使用前与DMSO混合，配制成质量浓度为1、5、10 μg/mL的溶液；免疫组织化学染色试剂盒（上海邦景实业有限公司，批号：BJ-15041）；HE染色试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：ZN1970）；兔抗大鼠CD31一抗（批号：ab28364）、兔抗大鼠VEGF一抗（批号：ab32152）、兔抗大鼠bFGF一抗（批号：ab208687）均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 ALC-H型大鼠电动脑立体定向仪（上海奥尔科特生物科技有限公司）；微量注射泵（淮北软隆生物科技有限公司）；MacroMR型小动物核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）成像仪（苏州纽迈分析仪器股份有限公司）；H7500型电子显微镜（日本株式会社日立制作所）；iBright Imager型凝胶成像分析系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模与分组[5]大鼠适应性喂养7 d后开始建模。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，以立体定向仪固定于操作台，头顶部正中垂直切口，长度5 mm，采用楔形高速钻头在矢状缝及冠状缝左侧3 mm位置钻一个直径为0.9 mm的骨窗。显微镜下采用1 mL空针针尖将尚未完全磨开的硬脑膜分离。采用无菌注射器采集大鼠尾静脉静脉血600 μL，调整立体定向仪使注射器前端锥形开口在下降时可恰好嵌顿于骨窗，启动微量注射泵，以30 μL/min的速度缓慢向硬膜下隙注射非抗凝自体血液300 μL，全部注入硬膜下腔后，调整速度为10 μL/min注射10 min，防止迅速注血引发颅内压急剧升高或急性脑损伤，两个阶段注血共计400 μL。血凝后将注血针拔除，缝合切口，常规消毒。建模成功标准：建模后3、10、17、24 d采用3.0 T MRI扫描检测大鼠头部，如首次注血后第3天急性期血肿在T2WI序列图像上呈现为位于额顶颞叶及硬脑膜之间的椭圆形高信号影像，且后续扫描无严重挫裂伤、血肿突破、重度脑水肿表示建模成功。10只大鼠仅开骨窗、缝合，作为假手术组。50只大鼠建立CSDH模型，3只死亡，40只建模成功，将建模成功大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只。

1.5 实验给药 建模后24 d确认建模成功后开始给药。低、中、高剂量组大鼠分别按照1 mL/100 g腹腔注射质量浓度为1、5、10 μg/mL的海风藤醇提取物DMSO溶液，假手术组、模型组大鼠均按照1mL/100 g腹腔注射DMSO溶液。1次/d，连续给药14d。

1.6 观察指标

1.6.1 硬膜下血肿体积 末次给药后次日，采用3.0 T MRI扫描检测各组大鼠头部，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，将其置于MRI扫描专用线圈中，设置为T2WI序列进行冠状位扫描，层厚：1 mm。选取血肿体积最大断层截面，测量血肿纵径、横径，记录血肿层面，计算血肿体积。

1.6.2 大鼠神经功能评价 末次给药后次日，采用Zea Longa评分法评价大鼠神经功能[6]。0分：无神经功能缺损；1分：对侧前爪不能完全伸张；2分：向对侧转圈行走；3分：向对侧行走倾倒；4分：意识模糊，难以站立爬行。分数越高，提示大鼠神经功能损伤越严重。

1.6.3 组织取材 MRI扫描及大鼠神经功能评价完成后，脱颈处死大鼠，剥离大鼠血肿外膜，分为两份，一份用4%多聚甲醛固定，病理切片机切成4 μm厚度切片，用于免疫组化染色及HE染色，一份保存于液氮中用于Western blotting检测。

1.6.4 硬膜新生血管密度 取硬膜组织切片，脱蜡后PBS冲洗，3%过氧化氢孵育15 min，PBS浸泡30 min。滴加枸橼酸盐抗原修复液，微波后冷却至40 ℃，蒸馏水冲洗。滴加山羊血清室温下封闭15 min，弃血清。滴加兔抗大鼠CD31一抗（1∶800），湿盒中4 ℃过夜，PBS冲洗。山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000），37 ℃孵育15 min，PBS冲洗。DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，常规脱水，中性树胶封片。显微镜下观察，随机选取5个不相邻视野，计算新生血管密度。

1.6.5 硬膜组织病理变化 取硬膜组织切片常规脱蜡，冲洗1 min，苏木精染液染色5 min，冲洗，滴入1%盐酸酒精，冲洗2 s，促蓝液反蓝，冲洗15 s，1%伊红染液染色30 s，自来水冲洗，使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，每次3 s，中性树胶封固，显微镜下观察病理变化。

1.6.6 硬膜组织中VEGF、bFGF蛋白表达水平 取液氮保存的硬膜组织，RIPA裂解液裂解，BCA试剂盒定量蛋白浓度。取30 μg待测样本上样，沸水浴5 min，离心取上清，恒压下经10%SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳后湿转至膜，室温下封闭液封闭2 h，加入兔抗大鼠VEGF、bFGF一抗（1∶500），4 ℃摇床孵育过夜，洗涤，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室温孵育1 h，暗室中显影、定影，凝胶成像系统扫描，目的蛋白表达量以其条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值表示。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0软件分析数据，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多样本比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 假手术组大鼠均无神经功能缺损；与模型组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠神经功能评分均明显降低（P＜0.05），且具有剂量依赖性；与低剂量组比较，中剂量组大鼠神经功能评分明显降低（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组大鼠神经功能评分明显降低（P＜0.05）。（见图1）

图1 各组大鼠神经功能评分比较（，n=10）

2.2 各组大鼠硬膜下血肿体积比较 与模型组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠硬膜下血肿体积明显缩小（P＜0.05），且呈剂量依赖性；与低剂量组比较，中剂量组大鼠硬膜下血肿体积明显缩小（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组大鼠硬膜下血肿体积明显缩小（P＜0.05）。（见图2）

图2 各组大鼠硬膜下血肿体积比较（，n=10）

2.3 各组大鼠新生血管密度比较 采用免疫组织化学染色检测血管标志蛋白CD31蛋白表达，CD31蛋白标记的新生血管内皮细胞阳性染色为棕黄色或棕褐色。结果显示与假手术组比较，模型组大鼠CD31蛋白表达增加；与模型组比较，低剂量组大鼠CD31蛋白表达减少；与低剂量组比较，中剂量组大鼠CD31蛋白表达减少；与中剂量组比较，高剂量组大鼠CD31蛋白表达减少。（见图3）

图3 各组大鼠硬膜新生血管密度比较（免疫组化，×200，标尺50 μm）

与假手术组比较，模型组大鼠血肿外膜新生血管密度明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组大鼠血肿外膜新生血管密度明显降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组大鼠血肿外膜新生血管密度明显降低（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组大鼠血肿外膜新生血管密度明显降低（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠新生血管密度比较（）

表1 各组大鼠新生血管密度比较（）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05

2.4 各组大鼠硬膜组织病理变化情况 假手术组大鼠硬膜组织染色较浅，未观察到血肿及炎症反应；模型组大鼠硬膜组织颜色深暗，可观察到大量血肿，以及炎症细胞浸润、组织增生；低、中剂量组大鼠硬膜组织血肿开始吸收，血肿与脑皮层间逐渐形成包膜，血肿内可观察到机化组织；高剂量组大鼠硬膜组织血肿被大部分吸收，内膜与外膜间仅可观察到薄层血肿，血肿内可观察到机化组织。（见图4）

图4 各组大鼠硬膜组织病理变化情况（HE，×100，标尺100 μm）

2.5 各组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）。（见图5～6）

图5 各组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF 蛋白表达Western blotting 图

图6 各组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF 蛋白相对表达量比较（，n=10）

3 讨论

CSDH是一种常见的神经外科疾病，血肿位于硬膜下腔中，占位血肿通过压迫脑组织导致其缺血、缺氧，并改变血脑屏障通透性从而引发一系列继发性损害[7]。研究显示[8-9]，高龄，头部外伤，酗酒，抗凝或抗血小板治疗，颅内病损，以及颅内压持续降低等均是CSDH发生的常见危险因素。目前，钻孔引流术是临床治疗CSDH的主要方式，但因该病发病位置特殊且好发于老年群体，整体疗效并不理想，且术后复发率较高[10]。CSDH在中医学中属“头痛”范畴，头部创伤伤及脑络，瘀血内滞、阻滞脑络是其主要病因，故治疗应以化瘀通络为主[11]。海风藤是常用的通络药物，其活性单体化合物在CSDH中的治疗意义及机制备受关注。

血肿包膜血管新生在CSDH发展过程中具有重要作用[12]。CSDH包膜质地厚，纤维蛋白溶酶原与新生毛细血管丰富，但因新生血管内皮细胞结构不完整、基膜不成熟，可反复生成与出血，并大多是畸形血管，通透性强，可刺激硬膜边缘细胞持续增生并不断形成新膜，导致血肿进一步增大[13-15]。本研究结果显示，与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠神经功能评分、血肿外膜新生血管密度均明显降低，血肿体积明显缩小，且呈剂量依赖性，提示海风藤醇提取物可促进大鼠神经功能的改善及血肿吸收，并抑制血管新生。海风藤具有抗炎、抗氧化、镇痛、抑制血小板活化、保护局部缺血组织等药理作用。从海风藤中分离的醇提取物主要包括黄酮类、生物碱、木质素类、环氧化合物、挥发油等，血小板活性因子拮抗作用极强，而血小板活性因子是CSDH脑损伤进程中关键的病理介质，推测海风藤醇提取物可有效阻止CSDH病理损伤过程，促进血肿吸收。

VEGF是目前已知的最为强效的血管生成促进因子，bFGF是最为有效的血管生成因子，两者具有明显的促进血管内皮细胞增殖与管腔形成作用，明显高表达于CSDH血肿腔及硬膜中，并参与血肿转归，可作为反映机体血管新生及修复功能的敏感指标[16]。有报道显示[17]，CSDH血肿壁中高VEGF表达的患者，面临着更高的钻孔引流术后复发风险，推测原因为其异常升高可扰乱血肿壁功能紊乱并致其血管增生，且明显增加微血管通透性。本研究结果显示，与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠硬膜组织中VEGF、bFGF蛋白相对表达量明显降低，且呈剂量依赖性，提示海风藤醇提取物对CSDH的治疗作用可能通过抑制VEGF、bFGF表达来实现。

综上所述，海风藤醇提取物可改善CSDH大鼠神经功能，抑制其血管新生，且表现为剂量依赖性，推测其作用机制与抑制硬膜VEGF、bFGF表达有关。海风藤醇提取物对CSDH的作用靶点是否存在多途径尚未明确，仍需进一步研究。此外，本研究未使用VEGF、bFGF激活剂对机制进行深入探索，将在后续实验中展开。