王志辉，王金强，王 智，童巧珍，刘湘丹,3，周日宝,3，桂 珏
（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室，湖南 长沙 410208；3.湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙 410208）
镉是生物体的一种非必需的微量元素，因其生物毒性大又极易被植物吸收而成为环境污染中最危险的五种物质之一[1]。我国镉污染超标率高达7.0%。镉是我国土壤污染中占重大比例的无机污染中最为严重的元素[2]，且镉污染治理难度大。大量研究表明，镉胁迫对植物种子的发芽率及生长发育存在明显的影响，如影响植物体的光合作用[3-4]，影响植物对矿质元素的吸收、分配，以及破坏植物叶片细胞膜、抑制细胞壁伸长[5-12]等。目前关于镉胁迫对植物的影响大多集中蔬菜、水稻等粮食作物上，近年来有学者对全国中药材中镉超标情况进行了统计，发现镉超标普遍存在，超标率达2.91%[11]。
决明又名草决明，豆科决明属植物，以种子入药，是一种药食两用的中药。目前已知决明子药效成分主要为大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、大黄酸等蒽醌类化合物[13-14]，有降血脂和抗动脉粥样硬化、抑菌、保肝、护肾等作用。笔者在前期研究发现决明在镉污染土壤中种植表现为镉低积累类型，决明子在不同程度污染的土壤中镉含量均未超标[15]。为证明镉污染地区决明种植的安全性和可适性，笔者通过测定不同镉溶液浓度梯度下决明种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数、根长、芽长和苗高等指标，考察决明种子对重金属镉的耐受性，并探究镉胁迫对决明种子发芽的影响，为进一步研究决明耐镉机制和镉污染地区决明的种植提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 GZX400型光照培养箱（泰斯特仪器有限公司）；UV1901PCS紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；氯化镉，丙酮等均为分析纯，培养皿，游标卡尺，蒸馏水（自制）。
1.2 供试种子 3种决明种子分别来于河北安国市天泽农业科技有限公司（A组）、天津市金科力峰种苗有限公司（B组）、广西南至北绿化种业（C组）。
1.3 镉溶液配置 重金属Cd2+以溶液的形式加入，以CdCl2·2.5H2O配成4个浓度：2、5、10、15 mg/L（以镉离子含量计）。
1.4 镉胁迫决明种子萌发实验 取饱满的决明种子经蒸馏水浸种24 h，选取大小基本一致的决明种子置于垫有棉花的培养皿中，每个培养皿放置20粒种子，标识Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，其中Ⅱ～Ⅴ分别加入20 mL的镉溶液2、5、10、15 mg/L，Ⅰ中加入20 mL的蒸馏水以作对照。然后将培养皿放入25 ℃的光照培养箱中培养，3 d后测发芽势，7 d后测发芽率（芽突破种皮1 cm算发芽）。每个处理重复3次。用40 ℃的温水浸泡决明种子24 h，然后用次氯酸钠消毒5 min，用自来水清洗种子数次，再用去离子水冲洗3次，备用。将消毒好的决明种子放于吸水纸上吸掉种子外部多余的水分,放于培养皿中,每皿种子30粒。分别称量每个培养皿的质量并记录，然后放入人工培养箱中培养（培养温度为25 ℃，光照12 h，黑暗12 h）。之后每天浇蒸馏水至恒重保持培养皿湿润，每天09:00:00时观察并记录发芽种子数，以将种子放入人工培养箱为实验的第1天，以连续3 d种子发芽数不再增长作为实验末期结束实验，结束当天在每个培养皿中随机选择10个幼苗，用游标卡尺测量根长（最长根）、苗长、鲜质量和干质量，并统计计算各数据。
1.5 测定萌发指标 当种子萌动后，逐日记录种子的发芽情况，并用下列公式计算种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数。发芽势=3 d正常萌发种子数/供试种子数×100%（式1）；发芽率=7 d正常萌发种子数/供试种子数×100%（式2）；发芽指数=ΣGt/Dt（Gt为t时间内的发芽种子数，Dt为对应的天数）（式3）；活力指数=发芽指数×苗高（苗高=平均芽长+平均根长）（式4）；抑制指数（%）=[（对照组-实验组）/对照组]×100%（式5）。
1.6 综合评价方法 采用模糊数学中的隶属函数法分析评价3个决明品种种子的耐镉性，参照陈露等（2019）的方法计算3个决明品种种子各指标的隶属函数值X(μ)和综合隶属函数值∑X（μ）。X（μ）=（xi-xmin）/（xmax-xmin）（i=1，2，3·n）式中，xi表示第i个综合指标，xmin表示第i个综合指标的最小值，xmax表示第i个综合指标的最大值。综合隶属函数值越大，耐性越强。
1.7 统计学方法 采用Excel、SPSS 23.0软件对所测数据进行分析，对3种决明种子在不同浓度的镉溶液下的各项指标使用Dunnett多重比较和方差齐性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 不同镉胁迫浓度下决明种子萌发各指标差异分析 A组决明种子经2、5mg/L镉溶液处理，其活力指数明显降低（P＜0.05），而其他萌发指标与对照比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明低浓度镉胁迫对A组决明种子的萌发影响较小。A组决明种子经10、15 mg/L镉溶液处理，其活力指数和发芽势明显降低（P＜0.05），表明镉浓度＞10 mg/L时对A组决明种子的萌发有抑制作用，且浓度越大，抑制作用越明显。（见表1）
表1 A 组决明种子在镉胁迫下的种子萌发指标（）
表1 A 组决明种子在镉胁迫下的种子萌发指标（）
B组决明种子经2 mg/L镉溶液处理，其活力指数明显升高（P＜0.05），表明镉浓度＜2 mg/L时，对B组决明种子萌发有促进作用。B组决明种子经5 mg/L镉溶液处理，其活力指数虽有所降低，但仍高于对照，且发芽率明显高于对照（P＜0.05），说明镉浓度达到5 mg/L时，仍可提高B组决明种子的发芽率。B组决明种子经10 mg/L镉溶液处理，各指标与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明B组种子最大耐镉浓度≥10 mg/L。B组决明种子经15 mg/L镉溶液处理，其各萌发指标均明显降低（P＜0.05），表明镉浓度为15 mg/L时，对B组决明种子萌发有抑制作用。（见表2）
表2 B 组决明种子镉胁迫下的种子萌发指标（）
表2 B 组决明种子镉胁迫下的种子萌发指标（）
镉浓度≥2 mg/L时，C组决明种子各萌发指标均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明低浓度镉胁迫即可影响C组决明种子萌发。（见表3）
表3 C 组决明种子镉胁迫下的种子萌发指标（）
表3 C 组决明种子镉胁迫下的种子萌发指标（）
由此可知，不同产地的决明种子耐镉能力存在差异，A、B组决明种子有较强的耐镉性，C组决明种子对镉胁迫敏感。
对3组决明种子在同一镉浓度下各萌发指标进行差异性分析可知，在对照条件下，B组决明种子的发芽指数与A、C组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而其他萌发指标差异均不明显，说明在无镉胁迫下，A、C组决明种子的活力优于B组。当镉浓度为2 mg/L时，C组决明种子的发芽指数、活力指数、发芽势和发芽率与A、B组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而A组与B组决明种子的各萌发指标差异均不明显。当镉浓度为5 mg/L时，C组决明种子的发芽指数、活力指数、发芽势和发芽率与A、B组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而A组决明种子仅活力指数与B组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明低浓度镉胁迫对C组种子影响更大。当镉浓度＞10 mg/L时，3组决明种子间各萌发指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明镉浓度超过10 mg/L时，对3组决明种子萌发的抑制程度是一致的。由此可知，3组决明种子耐镉能力存在差异，C组种子最高耐镉浓度不超过2 mg/L，A、B组决明种子最高耐镉浓度不超过10 mg/L。（见表4）
表4 不同品种发芽指标差异性分析
2.2 镉胁迫对决明种子根长、芽长和苗高的影响 在不同镉溶液处理下，A、C组决明种子的根长呈下降的趋势，而B组的根长呈先上升后下降的趋势。A组决明种子在镉浓度为10 mg/L时，根长明显短于对照（P＜0.05），根长抑制指数为54.46%；在镉浓度为15 mg/L时，根长抑制指数为71.79，说明镉浓度＞10 mg/L时，对A组决明种子的根长有明显的抑制作用。B组决明种子在镉浓度为2 mg/L时，根长明显长于对照，根长抑制指数为-38.75%，说明2 mg/L的镉溶液对B组种子的根长有促进作用，在镉浓度为5、15 mg/L时，根长明显短于对照（P＜0.05），说明镉浓度＞5 mg/L时，对B组决明种子的根长有抑制作用。C组决明种子在镉浓度5、10、15 mg/L时，其根长均短于对照（P＜0.05），并且在镉浓度为10 mg/L时根长降幅最大，根长抑制指数为51.10%，说明镉浓度＞5 mg/L时，对C组种子的根长有明显抑制作用。C组决明种子在镉浓度为15 mg/L时，其芽长明显短于对照（P＜0.05），其他各组芽长在不同镉溶液处理下与对照比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。由此可知，镉胁迫主要抑制决明种子胚根的生长，对胚芽的影响较小。（见表5）
表5 镉胁迫下决明种子根长、芽长、苗高及抑制指数
此外，在实验过程中还发现，在镉浓度为5 mg/L时，3组决明中有部分植株根系出现了较浅的褐变；在镉浓度为10、15 mg/L时，3组决明的根系均出现较深褐变，甚至有部分根系腐烂、坏死，而对照组未出现褐变腐烂现象，说明镉胁迫对决明根系有不同程度的损伤。（见图1）
图1 决明种子根部腐烂情况
2.3 不同品种耐镉性比较 利用种子萌发过程中发芽率、发芽指数和活力指数的隶属函数值和综合隶属函数值可综合分析3种决明种子在萌发期的耐镉性。由表6可知，B组种子耐镉性最强，A组次之，C组最弱。
表6 镉胁迫下决明种子萌发各指标隶属函数值
3 讨论
通过对3个品种决明种子的种子萌发耐镉性的研究发现，镉浓度低于5 mg/L时，A组决明种子各项指标变化较小，B组决明种子各项指标均有升高；而在镉浓度高于2 mg/L时C组决明种子萌发就会受到较大的抑制作用。结合综合隶属函数值可知，3种决明种子的耐镉能力为B＞A＞C。综上可见，A、B组决明种子都具有较强的耐镉性，适合在中、轻度镉污染地区种植，C组决明种子不适合在镉污染地区种植。
不同镉浓度胁迫下，A、B组决明种子的发芽势、发芽率与发芽指数的大致趋势都是先上升后下降，这与刘笑蓉等[16]认为低重金属浓度对植物有积极的“刺激作用”，但这种刺激受到浓度限制的说法一致。仅C组决明种子的发芽势在镉浓度为2 mg/L时就呈现出下降趋势，且与对照组有明显差异，说明C组决明种子对镉胁迫更敏感。
镉胁迫主要抑制决明种子胚根的生长，对胚芽的影响较小，不同镉浓度对不同品种决明根长的影响存在差异，B组表现出来是低镉浓度对决明有积极的“刺激作用”，但在超过一定浓度范围后，则受到抑制作用，这符合上述的结论。A、C组表现出随着镉浓度的升高而出现下降的趋势，该结果与郑本川等[17]在甘蓝型油菜种子中，低浓度镉处理状态下，随着镉浓度的增大，幼苗的根长和苗长的抑制率均呈上升趋势的研究结果一致。这种现象的原因还尚不清楚，可能与品种之间的耐镉性有一定差异有关。
3组决明根系发生褐变甚至腐烂坏死现象的具体原因需要进一步的实验探讨，造成这种现象的可能原因是在较高镉浓度下（5 mg/L以上），决明植株内部的蛋白质合成受到了抑制，植物的保护酶受到破坏，打破了细胞内活性氧产生和消除的动态平衡，导致植物根部表现出毒害症状或死亡[18-20]。
