黄 涛，邱盼子，欧阳波，田 霞，冯 淳，谢 谦，肖作奇
（1.湖南省妇幼保健院，湖南 长沙 410008；2.长沙市妇产科中药制剂研发中心，湖南 长沙 410008）
香芪生乳合剂具有通经下乳、益气养血的功效，临床用于治疗产后乳汁不足，气血亏损[1]。该制剂原方已在湖南省妇幼保健院使用二十余年，临床疗效确切，后经我院中医科专家依据临床经验研发为口服复方制剂，方便患者使用。该制剂原方由白芍、黄芪、人参、漏芦、当归、川芎、木香、炒王不留行等12味中药组成。方中白芍养血调经[2-3]；当归补血和血[4-5]，黄芪益气固脱[6-7]，两者合用共奏补气养血之功；川芎、木香行气、止痛[8-9]；人参是传统补益中药，具有补气生血、扶正祛邪等功效[10-11]；漏芦具有止血排脓、清热解毒、下乳消痈的功效[12]；王不留行行而不留，能行血脉，宣通苦泄，通乳汁[13]；通草可通胃经，取其通络下乳之功，使胃气上达而下乳汁[14-15]。诸药合用起到通经下乳、益气养血的作用[1]。
日常药检工作多以当归和川芎为对照药材及芍药苷、黄芪甲苷和去氢木香内酯为对照品的薄层色谱鉴别作为香芪生乳合剂的鉴别方法，然而中药复方制剂化学成分较多，单一的鉴别检验方法难以全面反映其质量特性。基于中药整体质量控制观，本研究采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（版本2004A）”对香芪生乳合剂复方及各单味药材进行指纹图谱研究，建立可靠、稳定、重复性好的方法，旨在为深化该制剂质量标准研究提供方法依据。
1 仪器与材料
1.1 主要仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配置检测器（DAD G1379B）、二元泵（G1312B）、柱温箱（G1316A）、化学工作站（Agilent Open Lab）、在线脱气机（G13222）（美国安捷伦公司）；1-14小型台式高速离心机（德国SIGMA公司）；XSR205电子分析天平（梅特勒托利多集团）；SB-50超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DFY-500高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。
1.2 试剂与试药 芍药苷对照品（批号：161108-160125，质量分数：96.3%）、阿魏酸对照品（批号：110773-201012，质量分数：99.6%）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201223，质量分数：95.9%）、β-蜕皮甾酮对照品（批号：200376-170525，质量分数：96.2%）、去氢木香内酯对照品（批号：111525-201711，质量分数：99.8%）均购自中国食品药品检定研究院。水为超纯水；乙腈（批号：19115172）、甲醇（批号：17045066）均为色谱纯（美国Tedia公司）；磷酸（批号：20190826）为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；中药饮片：当归（批号：20210715）、生地黄（批号：20210719）、黄芪（批号：20210715）、鹿角霜（批号：20210720）、麦芽（批号：20210719）、川芎（批号：20210713）、木香（批号：20210718）、炒王不留行（批号：20210421）均购自湖南省衡东县中药饮片厂；白芍（批号：2021061608）、漏芦（批号：2020062406）均购自湖南然润堂中药饮片厂；炮山甲（批号：20210201）购自石家庄柏林中药饮片厂。所有中药饮片由湖南中医药大学第二附属医院王竹鑫主任中药师鉴定均为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典》饮片要求，香芪生乳合剂由湖南省妇幼保健院药学制剂部提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为ACE EXCEL C18-AR柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，体积流量为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为203 nm，进样量为10 μL。梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取芍药苷、阿魏酸、β-蜕皮甾酮、人参皂苷Rb1、去氢木香内酯对照品2.040、10.760、19.730、23.440、12.020 mg，加入甲醇制成质量浓度分别为196.070、1072.190、949.000、2248.000、1200.000 μg/mL的对照品溶液。
分别向容量瓶中精密移取适量芍药苷、阿魏酸、β-蜕皮甾酮、人参皂苷Rb1、去氢木香内酯溶液，甲醇定容后，采用有机系滤膜（0.22 μm）过滤，即得混合对照品储备液。
2.3 香芪生乳合剂供试品溶液的制备 精密吸取5 mL香芪生乳合剂（批号：20220510）于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，涡旋3 min后，10000 r/min离心（离心半径为12 cm），取上清液过有机系滤膜（0.22 μm），即得。
2.4 单味中药材供试品溶液的制备 按照处方量分别称取香芪生乳合剂处方中药材，参照《湖南省医疗机构制剂规范》中方法，即将饮片置于不锈钢锅中，加适量水浸泡30 min后煎煮2次，第1次1 h，第2次40 min，合并煎液，放冷，滤过，滤液离心，减压浓缩，制得各单味药材煎液。精密吸取1 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，过有机系滤膜（0.22 μm），得单味药材供试品溶液。
2.5 方法学验证
2.5.1 精密度试验 取“2.3”项下香芪生乳合剂供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下重复进样6次，每次10 μL，记录色谱图。结果以阿魏酸（19号峰）为参照峰，测得各图谱共有峰相对保留时间RSD均小于0.8%，相对峰面积RSD均小于1.5%，表明仪器精密度良好。
2.5.2 稳定性试验 取香芪生乳合剂样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果以阿魏酸（19号峰）为参照峰，计算出各共有峰相对保留时间RSD均小于1.2%，相对峰面积RSD均小于1.9%，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。
2.5.3 重复性试验 取香芪生乳合剂样品，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下方法进样分析，记录色谱图。结果以阿魏酸（19号峰）为参照峰，计算出各共有峰相对保留时间RSD均小于1.4%，相对峰面积RSD均小于2.3%，表明该方法重复性良好。
2.6 HPLC指纹图谱的确立及共有峰归属
2.6.1 参照峰的选择及相似度测定 阿魏酸（19号峰）峰形好，峰面积最大，分离度较好，保留时间适中，也是香芪生乳合剂的主要药理活性成分之一，故选定为HPLC特征图谱的参照峰。
取10个不同批次香芪生乳合剂样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液10份，按“2.1”项色谱条件测定。将10批样品的图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版》，生成指纹对照图谱（见图1），结果显示：图谱有36个共有峰，与对照指纹图谱比对，10批香芪生乳合剂的相似度均大于0.96，说明不同批次香芪生乳合剂具有良好的相似性，中药饮片中化学成分及制剂质量比较稳定。（见表3）
表3 10 批香芪生乳合剂指纹图谱相似度结果
2.6.2 色谱峰指认及归属分析 取单味药材供试品溶液样品按“2.1”项下色谱条件测定后，将香芪生乳合剂和单味药材供试品溶液的图谱进行比对。（见图2）经分析发现，1、10、11、16、18、21、23、35、36 号峰来源于白芍；3、12、19、26、30、32、33、35号峰来源于当归；2、8、10、19、23、26、29、30、31、32、33、36号峰来源于川芎；1、3、25、26、30、32、33、35号峰来源于人参；3、12、15、22、23、24、26、29、30、33、34、35 号峰来源于木香；1、2、16、18、19、22、23、24、25、33、35、36号峰来源于生地黄；2、3、8、9、21、22、23、25、26、27、29、31、32、33、35、36号峰来源于黄芪；2、4、15、16、21、23、25、26、30、31、35、36号峰来源于炒王不留行；1、30、32、33、35、36号峰来源于鹿角霜；29、30、32、33、35、36号峰来源于通草；4、20、24、27、35、36号峰来源于漏芦；1、2、6、8、15、16、17、21、30、33、35、36号峰来源于麦芽。
图2 香芪生乳合剂和单味药材供试品溶液色谱图
取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定后，将香芪生乳合剂图谱与对照品进行对比。（见图3）鉴定出5种成分，即18号峰为芍药苷；19号峰为阿魏酸；20号峰为β-蜕皮甾酮；28号峰为人参皂苷Rb1；34号峰为去氢木香内酯。
图3 香芪生乳合剂主要色谱峰鉴定图
3 讨论
香芪生乳合剂是湖南省妇幼保健院药学制剂部基于名老中医经验方和根据临床一线的用药需求而开发出的中药复方制剂，主要用于产后乳汁不足，气血亏损。该复方中药制剂临床疗效显着、副作用低。
本研究考察了不同稀释倍数（2、3和5倍）对香芪生乳合剂供试品溶液出峰的影响。结果发现，将香芪生乳合剂稀释2倍时，获得的色谱峰丰富，信号响应较强，分离效果好；当稀释3倍时，获得的色谱峰数较多，但是峰形较差且出现峰分裂；当稀释5倍时，所获得的色谱峰数多，基线较平稳，但是个别峰信号响应较弱。
根据文献资料[16-21]，芍药苷、阿魏酸、β-蜕皮甾酮、人参皂苷Rb1、去氢木香内酯分别在230、316、247、203、225 nm处有最大吸收，综合对比上述5个波长，最后选择可测定的色谱峰数目较多、分离度较好和峰响应值较大的203 nm为检测波长。
本研究建立了香芪生乳合剂HPLC指纹图谱分析方法，该方法操作简单、准确可靠、重复性好且专属性强，可为有效控制该中药复方制剂的质量提供参考。
