★ 刘丹卓 赵新广 尤昭玲 左之文

(1.湖南中医药大学 湖南 长沙 410007；2.株洲千金药业股份有限公司 湖南 株洲 412003)

妇科千金胶囊是湖南株洲千金药业股份有限公司在妇科千金片基础上研制的中药四类新药，是国家医保甲类品种，国家计委重点支持中药，是目前用于治疗女性生殖器官炎症的知名品牌，临床疗效确切，市场前景良好。妇科千金胶囊作为千金药业的拳头产品，其用药安全性，目前仅有对其急毒、长毒评价方面资料。用药说明虽有孕妇禁用，但缺乏可信的禁用依据。有效评价药物对女性生殖功能的影响有着深远的意义，女性生殖系统是药物作用的一个特有的靶器官，女性生殖系统复杂且所有配子在出生前就已形成,所以其损害可能是多靶点及永久性的,并可导致完全绝育[1]。有鉴于此，本文通过其不同剂量对CHL细胞株体外染毒，进行遗传毒性测定,以期获得其继药效学之后的临床前毒效学资料，为其对育龄妇女特殊期(种子期、妊娠期、哺乳期)合理和安全应用提供实验学依据，并为构建和谐医患关系，走入国际市场提供必要的临床前安全性资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试物 妇科千金胶囊由湖南株洲千金药业股份有限公司提供，批号：20071226，含量或纯度：8.33g生药/g胶溶物，理化性质：溶于水(384mg胶溶物/mL)。室温20℃避光保存，临用时取胶溶物用双蒸馏水配成所需浓度的混悬液。

1.1.2 实验细胞株 中国仓鼠肺细胞(CHL)由中国药品生物制品鉴定所提供，由液氮冷冻保存。采用细胞培养基为F12培养液补加10%胎牛血清，在370C、5%CO2、饱和湿度环境中培养。

1.1.3 主要试剂与仪器 HAM F12培养基：GIBCO公司；胎牛血清：北京元亨金马；DMSO：北京化学试剂公司；天平：瑞士METTLER TOLEDO AL204DU-IC型；生物安全柜：美国Labconco DELTA型；恒温摇床：上海智城ZHWY-200B型。

1.1.4 阳性对照剂 间接诱变剂为环磷酰胺(Cyclophosphomide)，代号CP，来源于上海华联制药有限公司/011204，外观为白色粉剂，用生理盐水配制成20mg/mL-1母液，现用现配，稀释成50ug/mL-1应用液。直接诱变剂为丝裂霉素C(Mitomycin C),代号MMC，来源于Kyowa Hakko Kogyo Co.ltd/333AJG。外观为灰色粉剂，用生理盐水配制成200ug/mL-1母液，现用现配，稀释成25ug/mL-1应用液。

1.2 实验方法[1-5]

1.2.1 S9活化系统制备 取体重在160～200g健康Sprague-Dawley SPF/VAF雌性大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2007-0001。腹腔注射多氯联苯玉米油溶液(200mg/mL-1)，注射剂量为500mg/kg-1，5d后颈椎脱臼处死大鼠，制备肝匀浆。9 000g离心10min,取上清液(S9)分装，液氮冷冻保存；临用时，取S9进行S9混合液配制。S9混合液组成(mL)：0.1mLS9、8u molMgCL2、33u molKCL、5u molG-6-P、4u molNADP、0.5mL磷酸缓冲液(PH7.4)。

1.2.2 实验分组 依据预实验采用MTT方法观察妇科千金胶囊不同浓度对CHL细胞生长的抑制作用结果，设3个剂量组浓度分别为5 000、2 500、1 250μg/mL。同时设溶剂对照、S9对照及阳性诱变剂对照。

1.2.3 实验操作步骤及检测指标 (1)取处于对数生长期的CHL细胞培养体系，正常对照或3个剂量组分别加入相应剂量的应用液，加样体积均为40μL，阳性对照按照各自的浓度要求加入适当体积的溶液。其中，在-S9mix的条件下，不同浓度药物的作用时间各取两个时间点，即24h和48h；+S9mix时药物作用于细胞的时间为6h，然后换新鲜培养液继续培养24h和48h。(2)终止培养前2h秋水仙碱处理；0.25%胰蛋白酶液消化;离心管离心;低渗液低渗;固定液固定;离心,重复1次；滴片，酒精灯上干燥；10%Giemsa染色制片。(3)指标检测，每个浓度组至少观察100个中期分裂相，在油镜下分别记录细胞染色体的数量变化及畸变类型，然后根据畸变细胞数算得畸变率。结构畸变包括染色体型畸变和染色单体畸变，畸变类型包括断裂、缺失、易位、双着丝点和环等。

1.3 统计学分析 采用SAS 9.13版软件由计算机完成，计数资料进行χ2检验。

2 结果与分析

2.1 妇科千金胶囊不同剂量对CHL细胞染色体畸变影响I 直接诱变剂丝裂霉素C(MMC)在25ug/mL浓度下,CHL细胞染色体畸变率显着增高至60%，而溶剂对照组在-S9测试系统条件下,染色体结构畸变率为1%，阳性对照组与溶剂对照组比较差异非常显着(P<0.01)。妇科千金胶囊各不同剂量组，在S9非活化测试系统条件下，无论24h或48h收获CHL细胞，进行染色体畸变分析，染色体畸变率均在正常范围，并与溶剂对照比较无显着性差异(P>0.05)。见表1。

表1 妇科千金胶囊不同剂量对CHL细胞染色体畸变影响1

2.2 妇科千金胶囊不同剂量对CHL细胞染色体畸变影响II 间接诱变剂环磷酰胺(CP)在50ug/mL浓度下，在S9活化条件下染色体畸变率显着增高至70%，而溶剂对照组在+S9测试系统条件下,染色体结构畸变率为1%，阳性对照与溶剂对照相比具有统计学意义上的增加(P<0.01)。妇科千金胶囊各不同剂量组，在S9活化测试系统条件下，无论24h或48h收获CHL细胞，进行染色体畸变分析，染色体畸变率均在正常范围，并与溶剂对照比较无显着性差异(P>0.05)。见表2。

表2 妇科千金胶囊不同剂量对CHL细胞染色体畸变影响2

3 讨论

染色体是一条双螺旋结构的DNA链和比较松散地结合在蛋白质上的复合物。它是遗传单位基因的载体，具有独特的形态和结构，当受到外界诱变物作用时易出现损伤，即在形态及结构上发生畸变。染色体畸变的机制比较复杂，一般认为，诱变物主要作用于细胞分裂周期G1期，此时染色体尚未复制，易致染色体损伤产生畸变。由于CHL细胞株的不同世代之间，在细胞周期时间和克隆形成率等参数上没有明显差异，便于控制实验条件，且不受动物体内营养及生理、免疫状态影响，因而能定量研究，重复性也好，且能传代保存，便于进行形态学和超微结构等观察，并进行细胞化学、生物化学等分析。CHL染色体畸变试验是体外细胞培养染色体正向突变实验[6]，不但能判定染色体数目异常，尚能判定染色体结构变化。本文采用CHL细胞培养方法，直接诱变剂MMC在-S9条件下,CHL细胞染色体畸变率显着增高至60%，间接诱变剂CP在+S9条件下染色体畸变率显着增高至70%，而溶剂对照在+S9及-S9两种测试条件下,染色体结构畸变率均小于5%，且阳性对照与溶剂对照相比具有统计学意义上的增加(P<0.01)，这说明试验系统可信。妇科千金胶囊设5 000、2 500、1 250μg/mL不同剂量对CHL细胞进行体外染毒，结果无论24h及48h收集细胞，并在S9活化与非活化两种测试条件下，进行染色体畸变分析，各剂量组、溶剂对照染色体畸变率均在正常范围，说明其在本实验所确定的5000μg/mL内，初步认为无诱发CHL染色体畸变作用。

[1]刘育谷.卫生毒理学[M].北京：人民卫生出版社，2003.

[2]中华人民共和国卫生部药政局.新药(中药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)，1993.

[3]王治乔.新药临床前安全性评价与实践[M].北京：军事医学科学出版社，1997.

[4]王心如.毒理学实验方法与技术[M].北京：人民卫生出版社，2005.

[5]李勇，张天宝.发育毒理学研究方法和实验技术[M].北京：北京医科大学出版社，2000.

[6]Glart H, Bartsch L, Czich A, et a1.Salmonella strains and mammalian cells genetically engineered for expression of sulfotrans-ferases[J].Toxicol Lett，2004，82/83：829-834.