★ 闫立地（大庆师范学院生物工程学院 黑龙江 大庆 163712）
肝脏是酒精分解代谢的主要器官，但过度或有害饮酒会导致肝功能障碍以及肝细胞结构变异，引起酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）［1］。目前酒精已成为我国导致肝损伤的第二大因素［2］。虎眼万年青（Ornithogalum caudatumait）为百合科虎眼万年青属草本植物，全株皆可入药，其化学成分复杂，主要含皂苷、多糖等成分。虎眼万年青的药理作用包括抗肿瘤、增强免疫、镇痛抗炎、抗氧化、降血糖等，其中抗肝癌、抗炎和提高免疫力的作用尤为显着［3］，应用前景十分广阔。本实验应用虎眼万年青总皂苷对酒精所致的急性肝损伤小鼠进行治疗，通过对小鼠血清及肝组织匀浆液的生化指标进行检测，探究虎眼万年青总皂苷对急性酒精性肝损伤小鼠的治疗作用。
1 材料
1.1 实验动物 昆明种小鼠60只，雄性，体重18～20 g。由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，许可证号是SCXK(黑)2013-001。
1.2 实验试剂 虎眼万年青（购自吉林省长白朝鲜族自治县长白山中药研究所）；薯蓣皂苷标准品（纯度≥98 %，上海源叶生物科技有限公司）；52°红星二锅头白酒（北京红星股份有限公司）；硫普罗宁肠溶片（上海凯宝新谊药业有限公司）；谷丙转氨酶ALT试剂盒、谷草转氨酶AST试剂盒、甘油三酯TG试剂盒、超氧化物歧化酶SOD试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX试剂盒均购于南京建成生物研究所。
1.3 实验仪器 BSA-CW电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）； RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州世纪双科实验仪器有限公司）；HHS电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；SIGMA3-30K离心机（德国sigma公司）；UV725N分光光度计(上海科学精密仪器厂)。
2 方法
2.1 虎眼万年青总皂苷药品制备 运用乙醇热回流的方法，将虎眼万年青烘干后的全株粉末与80 %乙醇以1∶15的固液比，在70℃水浴下提取3次，每次3 h。将提取后溶液浓缩挥干乙醇后，经石油醚除杂，正丁醇萃取，干燥得虎眼万年青总皂苷浸膏［4］。采用香草醛-冰醋酸比色法测定虎眼万年青总皂苷含量，得标准曲线为Y=7.506 7X-0.446 1（r2=0.999 4），表明薯蓣皂苷在 0.07～0.15 mg 范围内和A值呈良好的线性关系。测得虎眼万年青总皂苷得率为0.42 %。
2.2 试验动物分组与酒精所致急性肝损伤小鼠模型的建立 雄性小鼠60只，按照随机数字表法随机分成空白对照组、模型组、阳性药物组、高剂量实验组、中剂量实验组、低剂量实验组，每组10只小鼠。
除空白对照组外的小鼠，每日给其余小鼠灌服52°白酒（0.24 mL/20 g），每天 1 次，连续 7 d，于第8 d小鼠酒精性急性肝损伤模型建立成功［5-6］。
2.3 给药治疗 第9 d开始进行给药治疗。根据已有研究皂苷类治疗小鼠肝损伤的文献［7］，将虎眼万年青总皂苷高、中、低剂量实验组分别按照体重以 60、30、15 mg/ kg虎眼万年青总皂苷溶液进行灌胃处理，参照参考文献［8］确定阳性药物硫普罗宁的给药剂量，为120 mg/kg硫普罗宁溶液溶液，灌胃体积皆为15 mL/kg，空白对照组及模型组灌以等体积蒸馏水。每天1次，连续7 d。
2.4 生化指标测定
2.4.1 血液指标测定末次灌胃后禁食不禁水12 h，小鼠眼球取血，1 500 r/min、4 ℃离心 15 min 得血清，测定小鼠血清中ALT、AST活力和TG含量，具体操作方法皆严格按照试剂盒说明书进行。
2.4.2 肝脏指标测定小鼠处死后，解剖取肝脏组织，加入生理盐水，冰水浴条件下进行匀浆，制成10 % 的匀浆液，2 000 r/min、4 ℃离心 10 min 取上清液为肝脏匀浆液，测定SOD、GSH-PX活力，具体操作方法皆严格按照试剂盒说明书进行。
2.5 统计学方法及处理 使用SPSS 20.0进行统计分析，结果用平均值±标准差（）表示，组间比较通过t检验进行分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 小鼠一般生理状态 空白对照组小鼠精神状况良好，行动自如，饮食如常，体重正常增加。模型组小鼠精神涣散嗜睡，有时极度狂躁，多饮多食，排泄物增多，体重基本保持不变，毛色光泽减少。虎眼万年青总皂苷实验组相比于模型组精神状况有所改善，体重有所增加，高剂量实验组改善最为明显。
3.2 对急性酒精性肝损伤小鼠生化指标影响
3.2.1 对急性酒精性肝损伤小鼠血清指标影响血清转氨酶活力升高反映了肝细胞受损程度［9］，由表1结果可知，与空白对照组相比模型组小鼠血清中ALT、AST活力均有显着升高（P＜0.01），说明急性酒精性肝损伤小鼠造模成功。与模型组比较，阳性药物组、高剂量实验组和中剂量实验组小鼠血清中ALT、AST活力明显降低（P＜0.01），但低剂量实验组小鼠血清中ALT、AST活力没有明显变化。因此证明虎眼万年青总皂苷可以改善肝细胞的受损程度。
酒精性肝损伤肝纤维化与血脂有密切的关系，当短时间内摄入大量酒精时，肝脏脂类物质大量积累并进入血液，则血液中的TG浓度会增加。由表1结果可知，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中TG含量明显升高（P＜0.01）说明急性酒精性肝损伤小鼠造模成功。与模型组相比较，阳性药物组、高剂量实验组小鼠血清中TG含量显着降低（P＜0.01），中剂量实验组小鼠血清中TG含量也有所降低（P＜0.05），但低剂量实验组小鼠血清中TG含量没有明显变化，呈现出明显的剂量依赖性。因此说明虎眼万年青总皂苷可以改善肝脏发生的脂肪性病变。
表1 虎眼万年青总皂苷对急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活力及TG含量的影响（，n=10）
表1 虎眼万年青总皂苷对急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活力及TG含量的影响（，n=10）
注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
组别 ALT（IU/L） AST(IU/L) TG（mmol/L）空白对照组 13.15±2.55 23.00±0.68 0.638 1±0.175模型组 43.17±4.33** 72.79±9.33** 0.870 7±0.089**阳性药物组 26.05±2.03## 57.30±4.14## 0.642 0±0.086##高剂量实验组 31.00±3.15## 46.20±4.37## 0.631 5±0.491##中剂量实验组 36.00±1.57## 60.59±3.88## 0.743 7±0.072#低剂量实验组 41.73±0.33 66.93±4.13 0.886 0±0.035
3.2.2 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指标影响酒精进入肝脏后，会导致肝细胞发生氧化应激，使得SOD和GSH-PX等抗氧化物大量消耗。因此肝细胞内SOD、GSH-PX活力可反映酒精性肝细胞受损程度。由表2结果可知，与空白对照组相比模型组小鼠肝脏中SOD和GSH-PX活力均明显下降（P＜0.01），说明急性酒精性肝损伤小鼠模型造模成功。与模型组相比，阳性药物组、高剂量实验组和中剂量实验组小鼠肝脏中SOD和GSH-PX活力皆有明显提高（P＜0.01），低剂量实验组小鼠肝脏中GSH-PX活力也有一定提高（P＜0.05）。说明说明虎眼万年青总皂苷可以缓解酒精所致急性肝损伤的小鼠肝细胞的氧化应激反应。
表2 虎眼万年青总皂苷对急性酒精性肝损伤小鼠肝部SOD和GSH-PX活力的影响（，n=10）
表2 虎眼万年青总皂苷对急性酒精性肝损伤小鼠肝部SOD和GSH-PX活力的影响（，n=10）
注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
组别 SOD（U/mg prot） GSH-PX（U/mg prot）空白对照组 40.86±6.48 355.15±25.45模型组 20.92±4.56** 171.12±33.61**阳性药物组 36.16±4.62## 262.21±26.69##高剂量实验组 34.43±3.14## 275.66±15.24##中剂量实验组 29.82±2.06## 234.29±8.76##低剂量实验组 22.91±2.02 207.44±12.27#
4 讨论
酒精性肝损伤是指长期或短期内大量饮酒，过量的酒精在肝脏中经过一系列的反应可导致肝细胞线粒体的损伤等氧化应激损伤，使脂肪大量蓄积于肝脏之中，造成肝脏损伤的一种疾病［10］。目前研究表明，肝脏是酒精代谢的主要场所，乙醇在肝细胞内经乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）氧化代谢为乙酸。正常情况下机体有相对完善的抗氧化系统，包括SOD和GSH-PX等的酶抗氧化系统，能对抗其在氧化过程中产生的活性氧和活性氮分子［11］。但当短期内大量的乙醇进入肝脏细胞时，乙醇被转化为乙醛，抑制三羧酸循环引起脂质过氧化反应产生大量自由基和脂质过氧化产物（如MDA），此时酶抗氧物系统超负荷工作，使SOD和GSH-PX等抗氧化物被大量消耗，出现氧化应激反应，产生一系列的级联反应导致肝脏细胞发生进一步的损伤。导致膜的流动性降低，通透性升高，使肝脏细胞内的ALT和AST等转氨酶大量游离，导致肝脏细胞外及血清中转氨酶活力急剧增大。同时短期内过量的乙醇摄入会造成三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化障碍，影响脂肪代谢，导致TG在肝脏中大量蓄积，从而TG大量进入血液，使血液中的TG含量显着增加。
本研究结果表示，与模型组相比，高剂量与中剂量实验组肝脏组织中SOD和GSH-PX活力皆有明显提高（P＜0.01）这说明虎眼万年青总皂苷具有一定的抗氧化能力，可提高机体内抗氧化物水平，减少氧化应激反应，此结论与徐阳等［12］得出的虎眼万年青总皂苷成分具有抗氧化能力的结果一致。血液中ALT和AST活力是临床上评价肝损伤的常见指标，与模型组相比较，虎眼万年青总皂苷高剂量实验组血清中ALT、AST活力显着降低（P＜0.01）。说明虎眼万年青总皂苷能有效治疗酒精所致的急性肝损伤，且具有一定的量效关系（效果：高剂量＞中剂量），低剂量几乎无治疗效果。
目前认为，急性酒精性肝损伤发生机制中的一个重要环节是酒精导致的氧化应激［13-14］。通过研究清楚的发现虎眼万年青总皂苷可以使酒精所致急性肝损伤的小鼠肝部的SOD和GSH-PX活力提高，增加肝脏细胞的抗氧化物能力，减少酒精所致的氧化应激，减少肝脏细胞的进一步损伤，从而达到的治疗急性酒精性肝损伤的作用。
至今只有宛莹［7］得出虎眼万年青总皂苷对肝损伤有保护作用，但与本项目的区别较大。给药目的不同：已有文献的给药目的预防性给药，本项目为治疗性给药。本项目研究目标为虎眼万年青对肝损伤的治疗作用，即在过量饮酒引起肝损伤后，判断虎眼万年青是否能够有效治疗急性肝脏损伤。造模方式的不同：已有文献的造模方式为腹腔注射对乙酰氨基酚或灌胃给予他克林，而本项目采用了灌胃高度白酒的方式建立急性酒精性肝损伤模型，更好地模拟了人体的过量饮酒。
综上所述，虎眼万年青总皂苷对酒精所致的急性肝损伤小鼠具有一定的治疗作用，其机制可能与虎眼万年青总皂苷具有抗氧化能力和缓解氧化应激有关。现我国虎眼万年青的标准化栽培已在吉林省长白县形成，可年产200吨以上鲜品原料，且虎眼万年青具有广阔的开发、研究及临床应用前景。该实验可为进一步开发利用虎眼万年青药用资源提供依据。
