基于NF-κB 经典信号通路研究黄芩素对高糖诱导HK-2 细胞损伤的保护作用

★ 邓茜 孙惠力 曾又佳 宋高峰（深圳市中医院肾病科 广东 深圳 518033）

糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）是导致终末期肾脏病的最常见原因之一，在过去数十年里由于糖尿病患者增加，其发病率和患病率也随之上升，给人类健康带来严重危害［1］。黄芩素是从黄芩根中分离纯化提取的一种黄酮类化合物，实验研究发现，黄芩素可显着减少糖尿病大鼠肾内炎症介质的表达和单核/巨噬细胞浸润，减少细胞外基质，减轻肾小球和肾小管损伤，减少蛋白尿的生成，从而延缓DKD 进程［2］。高血糖是糖尿病最主要的代谢异常，亦是糖尿病肾脏病重要的致病因素。肾小管上皮细胞（HK-2）受各种糖尿病代谢底物高糖等影响，从而分泌促炎症、促纤维化分子及上皮细胞向充间质细胞转化，造成肾小管间质炎症、纤维化及肾功能损伤［3］。本课题组前期研究发现，高糖诱导的HK-2 的毒性损伤具有一定浓度依赖关系，其机制与NF-κB 通路的激活有关，与渗透压作用无明显关联［4］。NF-κB 信号通路是经典炎症信号通路之一，其介导的炎症反应在DKD的病理发展过程中起着十分重要的作用［5-6］，但其在糖尿病近端肾小管上皮细胞损伤中的作用尚不明确。本研究旨在从细胞水平观察黄芩素对高糖诱导HK-2 细胞NF-κB 经典信号通路关键蛋白（IκBα、p65、p-p65、IKKα）及其下游炎症分子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响，探讨其治疗糖尿病肾脏病的作用和机制，为开发中药单体成分黄芩素治疗糖尿病肾脏病提供理论基础。

1 材料

1.1 实验细胞

人近端肾小管上皮细胞株（HK-2）购自美国ATCC 公司，货号CRL-2190TM。

1.2 主要试剂

黄芩素和NF-κB 特异抑制剂PDTC 购自美国Sigma 公司；NF-κB 信号通路关键蛋白抗体试剂盒（IκBα、p65、p-p65、IKKα）、α-tubulin 抗体和HRP 标记的二抗均购自美国CST 公司；DEME/F12培养基和DMEM 低糖培养基购自北京赛默飞生物化学有限公司；胎牛血清购自美国Gibico 公司；BCA 蛋白试剂盒购自美国Pierce 公司。

2 方法

2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全生长培养基培养，培养条件为37 ℃，95%湿度，5%CO2的细胞培养箱，每周换液2～3 次。当细胞生长融合至约80%时，用0.25% Trypsin/0.53% EDTA 溶液消化、传代。

2.2 主要试剂配制

45 mmol/L 高糖DMEM 培养基：将0.356 g 葡萄糖粉末溶入50 mL 含5.5 mmol/L 葡萄糖 DMEM 培养基中，超净台内0.22 μmol/L 滤膜过滤除菌，4 ℃存放待用。

黄芩素：超净台内100 mg 黄芩素溶入3.7 mL DMSO，配制成浓度为0.1 μmol/μL 的原液，室温避光保存。使用时45 mmol/L 高糖DMEM 培养基稀释成所需终浓度。

NF-κB 特异抑制剂PDTC：超净台内16.6 mg PDTC 溶入0.981 mL DMSO，配制成浓度为0.1 μmol/μL的原液，4 ℃避光保存。使用时用45 mmol/L 高糖DMEM 培养基稀释成100 μmol/L 的终浓度。

2.3 实验分组

当细胞生长融合至约80%时，用DMEM 低糖培养基无血清同步化48 h，然后分组如下：正常糖对照组（5.5 mmol/L 低糖DMEM 培养基，NG）、高糖组（45 mmol/L 高糖DMEM 培养基，HG）、黄芩素低剂量组（25 μmol/L 黄芩素+高糖组）、黄芩素中剂量组（50 μmol/L 黄芩素+高糖组）、黄芩素高剂量组（100 μmol/L 黄芩素+高糖组）、NF-κB 特异抑制剂PDTC 组（100 μmol/L PDTC +高糖组）。

2.4 细胞总蛋白提取

各实验组干预24 h，终止培养并收样：弃去上清液，预冷PBS 冲洗1 次，加入1×细胞裂解液100～120 μL/皿，冰上静置10 min，细胞刮反复刮下细胞，低温离心机离心，13 500 r/min，10 min，吸取上清液，-80 ℃冰箱保存。

2.5 Western blot 检测方法

用1×细胞裂解液配平BCA 蛋白定量测得的各样品蛋白浓度，每孔总上样量为50～60 μg。电泳：积层胶电压90 V，待蛋白在积层胶和分离胶交界线压薄后，换成130 V 电压至溴酚蓝达分离胶底部，结束电泳。转膜：恒压100 V，时间120 min。丽春红染色。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。孵育一抗，4 ℃摇床过夜。室温孵育二抗1 h。化学发光、显影、定影。在凝胶成像和化学发光图像分析系统上扫描和进行灰度分析。每组实验重复3 次。

2.6 统计学方法

计量资料用均数±标准差（）表示。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，并进行两两比较。应用SPSS 16.0 统计软件进行分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芩素对高糖诱导的HK-2 细胞NF-κB 通路激活的作用

3.1.1 黄芩素干预对高糖诱导的HK-2 细胞IκBα蛋白表达的影响 高糖组IκBα蛋白表达下调，黄芩素中、高剂量组和PDTC 组抑制高糖诱导的HK-2 细胞IκBα蛋白表达下调，与高糖组比较差异有显着性（P＜0.05，P＜0.01）；黄芩素低剂量组与高糖组比较无显着差异（P＞0.05）。见图1。

图1 黄芩素对高糖诱导的HK-2细胞IκBα蛋白表达的影响

3.1.2 黄芩素干预对高糖诱导的HK-2 细胞p65活化的影响 高糖组p-p65/p65 比值上调，与正常糖对照组比较有显着差异（P＜0.01）；黄芩素中、高剂量组和PDTC 组抑制高糖诱导的HK-2 细胞p-p65/p65 比值上调，与高糖组比较差异有显着性（P＜0.05，P＜0.01）；黄芩素低剂量组与高糖组比较无显着差异（P＞0.05）。见图2。

图2 黄芩素对高糖诱导的HK-2 细胞p65活化的影响

3.1.3 黄芩素干预对高糖诱导的HK-2 细胞IKKα蛋白表达的影响 高糖组IKKα蛋白表达上调，与正常糖对照组比较有显着差异（P＜0.01）；黄芩素中、高剂量组能下调高糖诱导的HK-2 细胞IKKα蛋白表达，与高糖组比较有显着差异（P＜0.05，P＜0.01）。见图3。

图3 黄芩素对高糖诱导的HK-2细胞IKKα表达的影响

3.2 黄芩素干预对高糖诱导的HK-2 细胞炎症分子MCP-1、ICAM-1 表达的影响

高糖组MCP-1、ICAM-1 蛋白表达上调，与正常糖对照组比较有显着差异（P＜0.01）；黄芩素中、高剂量组和PDTC 组能下调高糖诱导的MCP-1、ICAM-1 蛋白表达，与高糖组比较有显着差异（P＜0.05，P＜0.01）。见图4。

图4 黄芩素对高糖诱导的HK-2细胞MCP-1和ICAM-1蛋白表达的影响

4 讨论

DKD 与许多代谢紊乱有关，如活性氧产生过剩、缺氧状态、线粒体功能障碍和炎症等。现今对糖尿病肾脏病的认识有了很大进步，以肾小球为中心的病理生理学传统范式已经扩展到小管间质、炎症等，近端小管损伤的生物标志物已被证明与DN进展相关，独立于传统的肾小球损伤生物/标志物，如蛋白尿等［7］。许多研究已经证实炎症在糖尿病肾脏病的发病机制中起着关键的作用，而NF-κB信号通路是炎症信号的主要传导通路，包括经典NF-κB 信号通路和非经典NF-κB 信号通路［8］。本课题组的前期试验研究表明，黄芩素能够减轻链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠肾内炎症进程来延缓糖尿病肾脏病［9］，高糖诱导的HK-2 毒性损伤呈一定的浓度依赖关系，其机制与NF-κB 通路的激活有关，与渗透压作用无明显关联［4］。本课题组在前期研究的基础上，从细胞水平进一步研究黄芩素对高糖诱导HK-2 细胞损伤保护作用及是否与NF-κB 经典信号通路关键蛋白（IκBα、p65、p-p65、IKKα）有关。在哺乳动物中，核转录因子NF-κB 家族包括p65/RelA，c-Rel，RelB，NF-κB（p105/p50） 和NF-κB2（p100/p52）5 种蛋白质。p105 和p100 通过蛋白水解作用分别产生p50 和p52。p50 和p52 能与p65/RelA 蛋白形成二聚体复合物，此复合物能够与DNA 结合及调节核因子转录。正常情况下，核转录因子NF-κB 与其抑制性蛋白IκBα 结合，以无活性的状态存在于细胞质中。NF-κB 激活的中心环节是IκBα磷酸化导致IκBα蛋白降解，从而使NF-κB 解离出来。而高分子量IKK 是诱导IκBα磷酸化的主要激酶。IKK由3 个紧密结合的IKKα、IKKβ、IKKγ 亚基构成，IKKα、IKKβ 是IKK 的主要催化亚基。此外，当IκBα蛋白降解，p65 与IκBα解离后，p65 磷酸化是NF-κB 转录激活的关键；磷酸化的p65 能够调节蛋白质与蛋白质的交互作用，具有精确的核定位功能，促进胞浆中的p65 迅速入核，增强转录活性。研究发现，TNFα刺激GSK3B 和TBK1 缺乏的细胞能够正常诱导IκBα磷酸化降解IκBα蛋白，但是不能激活NF-κB。NF-κB 激活能协调细胞因子、黏附分子、趋化分子等多种炎症介质的表达。趋化分子MCP-1 和黏附分子ICAM-1 基因启动子调控区内有NF-κB 的结合位点，NF-κB 可与其基因启动子上κB 序列结合从而调节MCP-1 和ICAM-1的基因转录。

黄芩素是从黄芩根中提取分离纯化的一种黄酮类化合物，具有多种药理作用，临床主要用于抗炎、抗病毒。有研究发现黄芩素对肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用［10］。本研究发现，50 μmol/L、100 μmol/L 剂量的黄芩素呈剂量依赖性的显着抑制高糖诱导的HK-2 细胞IκBα蛋白表达下调，p-p65/p65 比值和IKKα、MCP-1、ICAM-1 蛋白表达上调，这表明在高糖诱导的HK-2 细胞损伤中，黄芩素可能通过抑制IKKα介导的IκBα降解和p65 磷酸化，抑制NF-κB 通路激活，从而下调其下游炎症分子MCP-1、ICAM-1 的表达，减轻HK-2细胞炎症损伤。此外，因PDTC 是NF-κB 的特异抑制剂，故在检测IKKα蛋白表达时未设PDTC 组。结果中黄芩素对高糖诱导的NF-κB 下游炎症分子MCP-1、ICAM-1 的抑制作用强于NF-κB 特异性抑制剂，这可能与黄芩素还可能通过抑制其他与MCP-1、ICAM-1 调控相关的信号通路有关，待进一步研究。

综上所述，本研究用高糖刺激人近端肾小管上皮细胞株（HK-2）建立糖尿病肾脏病肾小管损伤的体外实验模型，研究发现高糖可以诱导HK-2 细胞IKKα/IκBα/p65 通路激活，并上调其下游炎症分子MCP-1、ICAM-1 表达；黄芩素可以通过抑制高糖诱的HK-2 细胞IKKα/IκBα/P65 通路激活，下调其下游炎症分子MCP-1、ICAM-1 表达，与本课题的前期实验结果一致。提示黄芩素可能通过减轻肾脏细胞炎症来延缓糖尿病肾病的进展，且与抑制NF-κB 炎症信号通路的激活密切相关。