增液汤对干燥综合征模型鼠血清肿瘤坏死因子-α和白介素-1β的影响*

孙丽英，秦鹏飞，张 亮，孙红丽

黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040

增液汤对干燥综合征模型鼠血清肿瘤坏死因子-α和白介素-1β的影响*

孙丽英，秦鹏飞，张 亮，孙红丽

黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040

目的：观察增液汤对干燥综合征模型鼠血清中肿瘤坏因子-α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的影响。方法：将54只ICR小鼠随机分为6组：空白组，模型组，来氟米特组和增液汤高、中、低剂量组。采用弗氏完全佐剂及ICR小鼠颌下腺蛋白抗原联合诱导干燥综合征（SS）动物模型，60天后眼球取血，采用ELISA法测定各组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。结果：模型组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；来氟米特组和增液汤高、中、低剂量组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均低于模型组（P＜0.05），增液汤高剂量组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明显低于来氟米特组（P＜0.05），中剂量组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明显介于高、低剂量组之间。结论：增液汤治疗SS模型小鼠的机制之一可能是降低了血清中TNF-α和IL-1β的表达水平，而且增液汤剂量越大效果越明显。

增液汤；干燥综合征；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β

干燥综合征(sjogren syndrome，SS)［1］是一种全身外分泌腺(特别是泪腺和唾液腺)的慢性炎症性的自身免疫病，主要表现为眼和口的干燥，且腺体外的系统如呼吸道、消化道、泌尿道、神经、肌肉、关节等均可受损。SS可分为原发性和继发性2种，前者指有干燥性角结膜炎和口腔干燥而不伴有其他结缔组织病；而后者则指伴发其他结缔组织病。其特征主要为外分泌腺特别是泪腺和唾液腺高度淋巴细胞浸润，且血清中可检测到多种自身抗体。现代的科学研究并未阐明其发病的根本原因，治疗主要以改善症状为主。中医将本病归为“燥痹”“燥毒”“燥证”“虚劳”等范畴。《温病条辨》中增液汤的功效是增液润燥，在此基础上对症加减治疗该病收效良好。本实验主要通过观察增液汤对SS模型小鼠血清中肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的影响，进一步探讨增液汤在干预SS方面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 增液汤按《温病条辨》所载方用量：玄参30 g，生地黄24 g，麦冬24 g，上药均由黑龙江中医药大学附属第一医院中药房提供。将上述比例药材加8倍量蒸馏水浸泡半小时，煎煮60分钟，过滤煎液；再加6倍量蒸馏水煎煮40分钟，过滤煎液。合并2次滤液，浓缩成每毫升相当于生药材1.5g和0.5g的药液，冷却后4℃冰箱保存备用。西药药物：来氟米特片(优通)：常州华生制药有限公司生产，批号：H20090330。

1.2 实验动物 ICR小鼠，SPF级，雌性，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.3 实验仪器 DZKW-D-1型电热恒温水浴锅 (北京市永光明医疗仪器厂提供)，Anthos 2010酶标仪(郑州博赛生物工程有限责任公司提供)，涡旋式混匀器 (苏州捷美电子有限公司提供)，722型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司提供)，KDC-40低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司提供)。

1.4 主要试剂 弗氏完全佐剂(FCA)［美国sigma公司，批号：SLBB1397］；百白破疫苗(成都生物制品研究所有限责任公司生产，批号：20110846-1)；TNF-α、IL-1βELISA检测试剂盒(美国R＆D公司生产，批号：20130312)；考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，批号：20130315)。

1.5 实验方法

1.5.1 免疫用抗原的制备 脱颈处死4只ICR小鼠，75%酒精擦拭颈部，无菌操作台上快速取出小鼠两侧颌下腺，分离包膜及结缔组织，用生理盐水洗净，无菌滤纸吸干，称重，剪碎，匀浆，每0.1 g加灭菌PBS缓冲液2mL，4℃低温离心机中离心(3 000 rpm×20min)，取上清液置10mL无菌试管中，采用考马斯亮蓝比色法测定抗原蛋白含量，用灭菌PBS缓冲液将抗原蛋白稀释至1mg/mL，加入等体积FCA，使抗原乳化成油包水状态，抗原最终浓度为500μg/mL。

1.5.2 分组及处理 将小鼠随机分为6组，每组9只，分别为空白对照组(A)，模型组(B)，来氟米特组(C)，增液汤高剂量组(D)，增液汤中剂量组(E)，增液汤低剂量组(F)。A组不作处理，B～F组两后脚掌及两侧腹股沟皮下注射乳化蛋白抗原，每只脚掌及每侧腹股沟皮下均注射0.05mL。首次免疫后第2天和第8天，B～F组每只小鼠腹腔注射百白破疫苗0.05mL。第8天，B～F组小鼠背部皮下多点注射乳化蛋白抗原加强免疫。之后每隔14天加强免疫一次，均为背部皮下多点注射。A组、B组小鼠每日灌服生理盐水，0.02mL/g；C组小鼠每日灌服阳性对照药来氟米特溶液(按人每日用量等效计算)，0.02mL/g；D组小鼠每日灌服高剂量增液汤(每毫升相当于生药材1.5g)，0.20mL/g；E组小鼠每日灌中剂量增液汤(每mL相当于生药材1.0 g)，0.02mL/g；F组小鼠每日灌服低剂量增液汤(每毫升相当于生药材0.5 g)，0.02mL/g。首次免疫后第60天，对小鼠进行眼球取血，血浆室温静置20分钟后，2 000 r×15min离心取上清液，-20℃保存备用。

1.5.3 操作方法 严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.6 统计学方法 全部数据均采用SPSS 19.0软件进行处理。

2 结果

增液汤对SS小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影响见表1。

表1 增液汤对SS小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影响(±s)pg/mL

表1 增液汤对SS小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影响(±s)pg/mL

注：与空白组比较，△表示P＜0.01；与模型组比较，▲表示P＜0.01。

组别 例数 TNF-α含量 IL-1β含量空白组 9 53.26±7.89 30.01±4.99模型组 9 126.33±10.07△132.78±20.15△来氟米特组 9 76.50±6.94△▲66.78±9.51△▲增液汤高剂量组 9 71.57±8.12△▲49.22±10.56△▲增液汤中剂量组 9 78.17±9.24△▲62.67±11.07△▲增液汤低剂量组 9 84.17±11.14△▲78.67±11.97△▲

由表1结果可见，与空白组比较，模型组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，来氟米特组和增液汤高、中、低剂量组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；增液汤高剂量组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量与来氟米特组比，差异有统计学意义(P＜0.01)，中剂量组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明显介于高、低剂量组之间。

3 讨论

干燥综合征是一种慢性炎症性的自身免疫疾病，在其发病过程中，存在大量淋巴细胞浸润泪腺和唾液腺，产生大量炎性细胞因子，促使B、T淋巴细胞增殖，进一步损害组织器官，最终导致腺体功能丧失。TNF-α是调节细胞生长、分化、诱发炎症并调控细胞凋亡的细胞因子之一，能促进B、T淋巴细胞产生抗体，引起炎症反应。IL-1β是炎症反应的重要介质，是诱发炎症反应的主要环节之一，能激活其他炎症介质的合成。动物实验及临床研究表明：TNF-α及IL-1β在SS小鼠涎腺局部破坏和放大全身免疫紊乱中发挥关键作用［2］。

本实验结果显示：来氟米特和增液汤高、中、低剂量均可以改善SS小鼠的炎症反应，表现为TNF-α和IL-1β在血清中的表达水平显着降低(P＜0.01)，其中，增液汤高剂量效果优于来氟米特(P＜0.01)。提示增液汤可能通过抑制T、B淋巴细胞的增殖，减少炎性细胞因子的产生，并且从高、中、低剂量的对比可以看出增液汤高剂量组效果明显优于中、低剂量组。说明在临床上应用时要先从大剂量考虑使用［3-4］。增液汤在改善SS的症状方面发挥了很大的作用，可以为临床更好的治疗SS提供理论支持。但是SS的发病机制尚未完全阐明，增液汤是否通过其他机制参与了SS的发病过程，有待进一步研究［3］。

［1］ 中华医学会风湿病学分会.干燥综合征诊治指南(草案)［J］.中华风湿病学杂志，2003，7(7)：446-448.

［2］ 赵文鹏.周期联合免疫抑制剂对干燥综合征模型小鼠治疗作用及TNF-α、IL-1β表达的影响［D］.太原：山西医科大学，2008.

［3］ 何志军.陇中消定膏对足舟状骨缺血性坏死的临床疗效观察［J］.西部中医药，2013，26(8):25-26.

［4］ 吴国琳，普兴宏.养阴益气活血法对干燥综合征NOD小鼠颌下腺的干预作用研究［J］.西部中医药，2012，25(6):29-34.

Researcheson the ZengYe Tang in the Influencesof TNF-αand IL-1βover the SSRats

SUN Liying,QIN Pengfei,ZHANG Liang,SUN Hongli
Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China

Objective:To observe the effectof the ZengYe Tang on the tumornecrosis factor(TNF-α)and interleukin-1β(IL-1β)in the serum of ratswith Sjogren syndrome(SS).Methods:Totally 54 ICR ratswere random ly divided into 6 groups:the blank group,themodelgroup,the leflunomide group and the ZengYe Tang groupsof high, m iddle and low dosages.The SS ratmodelswere induced by injecting complete Freund adjuvant(CFA)and protein antigen of the submandibular gland of ICR rat.On the 60th day,the TNF-αand IL-1βlevels in the serum collected from the eyeballs were determ ined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results:The contents of TNF-αand IL-1βof rats in themodelgroup were allhigher than that in the blank group,the two groups had significant differences(P＜0.05);the TNF-αand IL-1βlevels in the leflunomide group and the ZengYe Tang groups of high,m iddle and low dosageswere all lower than those in themodelgroup(P＜0.05),especially in the group ofhigh dose they were significantly lower than those in the leflunomide group (P＜0.05)and in them iddle dose group the levelswere between the high and low groups.Conclusion:One of themechanisms of ZengYe Tang in the treatment of SS ratmay be relevant to its function in decreasing the expression of serum TNF-αand IL-1βlevels and its dosages,the higher,the greater.

ZengYe Tang;SS;TNF-α;IL-1β

R285.5

A

1004-6852(2015)02-0013-03

2014-07-04

黑龙江省教育厅科学技术研究项目计划（编号12511529）。

孙丽英(1966—)，女，硕士研究生导师，博士学位，教授。研究方向：方剂的配伍规律及疗效客观化。