正交实验优选甘草总黄酮和总皂苷提取工艺*

赵　妮，邓　毅△，刘　靓，董金香，曼　琼甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；甘肃省中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室



正交实验优选甘草总黄酮和总皂苷提取工艺*

赵妮1，邓毅1△，刘靓2，董金香2，曼琼2
1甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2甘肃省中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室

［摘要］目的：优化甘草总黄酮和总皂苷的超声提取工艺。方法：以提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比为考察因素，以总黄酮和总皂苷含量为综合评分作为评价指标，优选出最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺：提取温度为50℃，提取时间为45分钟，乙醇浓度为60％，料液比为1∶10。结论：该提取工艺简便、快捷，可用于甘草总黄酮、总皂苷的同时提取，为甘草进一步研究与利用奠定基础。

［关键词］甘草；总黄酮；总皂苷；正交实验；提取工艺

Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids and Total Saponins from GanCao by Orthogonal Test

ZHAO Ni1,DENG Yi1△,LIU Liang2,DONG Jinxiang2,MAN Qiong2
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2 Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province

Abstract Objective:To optimize ultrasonic extraction technology of total flavonoids and total saponins from GanCao (Glycyrrhiza uralensis Fisch.).Methods:The best extraction technology was optimized by taking extraction temperature,extraction time,the concentrations of ethanol and solid-liquid ratio as the factors,the contents of total flavonoids and total saponins as evaluation indexes for comprehensive assessment.Results:The best extraction technology was:extraction temperature:50℃,extraction time:45 minutes,the concentrations of ethanol:60％,solid-liquid ratio:1:10.Conclusion:The extraction technology,simple,convenient and rapid,could be used for simultaneous extraction of total flavonoids and total saponins from GanCao,which could lay foundation for further study and utilization of GanCao.

Keywords GanCao;total flavonoids;total saponins;orthogonal test;extraction technology

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科甘草属(Glycyrrhiza)植物甘草的根和根茎，在中医处方中占有重要地位，素有“十方九草”之称［1-3］。甘草的活性成分主要包括三萜皂苷类和黄酮类，两者都具有保肝、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［4］。内生菌(Endophyte)是指存活于健康植物组织内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群，包括真菌、细菌和放线菌。20世纪90年代，有学者发现与植物长期共存的内生菌能产生与宿主植物相同或相似的活性成分后得到重视，并成为研究的热点。有研究表明［5］，甘草内生菌代谢产物具有与甘草药材相同或相似的生理活性，为此，笔者采用正交实验优选甘草总黄酮、总皂苷的最佳提取工艺，较大程度地提取甘草中的总黄酮和总皂苷，为甘草总黄酮和总皂苷的纯化，以及为后期研究甘草药效成分和其内生菌代谢产物活性成分间的相关性奠定基础。

1　材料

1.1仪器723型紫外分光光度计(厦门分析仪器厂提供)；KQ-500DE型数控超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司提供)；HH-S数显恒温水浴锅(江苏正基仪器有限公司提供)；台式低速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司提供)；BS-110S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司提供)。

1.2试药甘草采自甘肃省酒泉市金塔县，经甘肃中医药大学中药鉴定实验中心高级实验师林丽鉴定为正品；甘草酸铵盐(江苏永健医药科技有限公司生产，批号：YJ-140227)；甘草苷(江苏永健医药科技有限公司生产，批号：YJ-150310)；无水乙醇、甲醇、氢氧化钠、香草醛、冰乙酸、高氯酸均为分析纯。

2　方法与结果

2.1甘草总黄酮和总皂苷的含量测定

2.1.1提取方法精准称取甘草粉末0.2 g于50 mL锥形瓶中，加10倍量体积的60％乙醇，50℃超声提取45分钟，离心，得甘草提取液。

2.1.2对照品溶液的制备精密称定甘草苷和甘草酸铵盐，分别定溶于10 mL容量瓶中，制得浓度为0.161 7、0.508 2 mg/mL的甘草苷和甘草酸铵盐对照品溶液。

2.1.3甘草苷标准曲线［6］精密吸取甘草苷对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL依次置于10 mL的容量瓶中，各加入70 ％甲醇溶液1 mL摇匀后，再加10 ％ NaOH溶液2.5 mL显色，10分钟后用70％甲醇溶液定容，在410 nm波长下分别测定吸光度值，并以甘草苷质量(Y)为自变量，吸光度(X)为因变量，得回归方程：Y=0.3898X－0.0133，r2=0.999 4，甘草苷在0.025～0.407 mg线性关系良好。

2.1.4甘草酸铵盐标准曲线［7］精密吸取甘草酸铵对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2、3 mL于试管中，挥干溶剂，加5％香草醛-冰醋酸溶液0.25 mL，摇匀，加0.8 mL高氯酸，摇匀，在56℃水浴反应20分钟，取出自来水冷至室温，用不含对照品的溶剂作为空白，在589 nm波长处测定吸光度，并以甘草酸铵质量(Y)为自变量，吸光度(X)为因变量，得回归方程：Y=0.655 7X-0.042 7，r2=0.999 4甘草酸铵盐在0.016～0.485 mg线性关系良好。

2.1.5精密度实验精密吸取甘草苷和甘草酸铵盐对照品溶液0.4 mL、1.5 mL分别定溶于10 mL锥形瓶中，分别按“2.1.3”和“2.1.4”项下方法测定吸光度，平行操作5次。结果RSD甘草苷=0.16％，RSD甘草酸铵盐=0.14 ％。表明仪器精密度良好。

2.1.6加样回收率实验［8］精密吸取9份甘草提取液各5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，分别加入甘草苷对照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高浓度溶液各3份，按“2.1.3”项下方法分别显色后测定其吸光度，计算加样回收率。结果，平均加样回收率为101.7 ％，RSD=1.62 ％(n=9)。另精密吸取9份甘草提取液各5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，分别加入甘草酸铵盐对照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高浓度溶液各3份，按“2.1.4”项下方法分别显色后测定其吸光度，计算加样回收率。结果平均加样回收率为99.8％，RSD=1.23 ％(n=9)。

2.1.7含量测定精密吸取甘草提取液适量，分别按“2.1.3”和“2.1.4”项下方法分别测定总黄酮和总皂苷的吸光度，代入各自回归方程，计算二者含量。

2.2甘草总黄酮和总皂苷最佳工艺优选

2.2.1正交实验设计为寻求最佳提取组合，本实验中选用提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比作为考察对象，每个因素3个水平，以总黄酮和总皂苷含量为综合评分作为评价指标，进行L9(34)正交试验。因素表见表1。

2.2.2正交实验结果按照L9(34)正交设计表的条件进行实验，分别测定甘草总黄酮和总皂苷的含量。采用信息熵权重分析法确定总黄酮(A)和总皂苷(B)的权重系数分别为0.5，根据各指标的权重，计算综合评价指标，对正交实验数据进行综合分析。综合评分=(0.5A/17.285 3+0.5B/12.927 2)×100％。方差分析结果见表2，正交实验结果见表3。

表1　甘草总黄酮及总皂苷提取工艺水平因素

表2　综合评分方差分析结果

表3　甘草总黄酮、总皂苷提取工艺正交

由表2和表3可知B＞D＞A＞C，即提取时间＞料液比＞提取温度＞乙醇浓度，4个因素对提取率都有极显着性影响。最佳提取工艺条件为：A3B3C2D1，即提取温度为50℃，提取时间为45分钟，乙醇浓度为60％，料液比为1∶10。

2.2.3验证实验精密称取0.2 g甘草药材粉末，按上述最佳提取工艺条件提取，按“2.1.3.1”和“2.1.3.2”项下方法进行含量测定，平行提取3次，测定总黄酮和总皂苷的吸光度。结果综合评分：1.017 1、1.009 1、0.995 3 mg/g，RSD=1.09％(n=3)。表明提取工艺可靠、稳定、可行。

3　讨论

以芦丁作为对照品来测定总黄酮含量是最普遍、最常用的方法。芦丁属于黄酮醇类化合物，但是，甘草中黄酮类成分以二氢黄酮类(甘草苷、甘草素)和查耳酮类(异甘草苷、异甘草素)为主。因此，选用甘草中含量较高的甘草苷为对照品比选用芦丁更合理，误差更小。二氢黄酮类成分在10％氢氧化钠碱性条件下可以转化成查耳酮，利用这一的特性来测定甘草总黄酮的含量，可使测定结果更加准确、可靠。

香草醛在放置过程中易氧化而使颜色加深［9］，因此，在测定总皂苷含量时，香草醛-冰醋酸溶液需现配先用，并应尽量保证测量条件的一致性，以免引起误差。显色反应过程中，吸光度随着时间、温度、显色剂用量的改变而改变，本实验在测定甘草总皂苷的过程中严格控制了显色时间、反应温度、显色剂用量等条件，以防这些因素的改变而影响实验结果的准确性。

本实验利用正交实验优选总黄酮和总皂苷可以同时提取的最佳提取工艺，并以总黄酮(甘草苷、甘草苷元、异甘草苷等)和总皂苷(甘草酸、甘草次酸、异甘草次酸等)为综合评价指标，对甘草进行提取工艺研究，为甘草药效成分的纯化以及研究甘草内生菌代谢产物与甘草药材活性成分间的相关性奠定基础。在处理数据时，为了便于比较分析，对各指标数据进行必要的标准化处理，采用的是Ci/Cmax，即数据除以该组最大数据。

参考文献

［1］刘仁俊.浅谈甘草化学成分及药理作用［J］.中国中医药，2011，9(19):74-75.

［2］冯月，吴文夫，魏建华，等.甘草酸及甘草苷的提取纯化方法和药理作用研究进展［J］.人生研究，2012，24(3):46-50.

［3］王伟明，朱文全，张志波.甘草有效成分提取分离方法的研究进展［J］.黑龙江医药，2010，23(1):93-94.

［4］高雪岩，王文全，魏胜利，等.甘草及其活性成分的药理活性研究进展［J］.中国中药杂志，2009，34(21):2695-2700.

［5］邓毅，王艳，丁仁伟，等.甘肃甘草内生菌次生代谢产物抑菌活性初步研究［J］.中药材，2013，36(2):181-184.

［6］马子娇，许颖，刘佳，等.甘草废渣中甘草黄酮提取工艺研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，16(15):15-19.

［7］朱中佳，熊富良，张雪琼，等.甘草总皂苷的提取纯化工艺研究［J］.中成药，2011，33(2):341-343.

［8］马俊鹏，韩海霞，郭喜红，等.正交试验优选啤酒花总黄酮提取工艺［J］.中药材，2010，21(11):994-996.

［9］张中伟，谢明勇，王远兴，等.比色法测定苦瓜总皂苷［J］.南昌大学学报，2005，29(5):447-449．

通讯作者：△邓毅(1964—)，男，硕士研究生导师，教授，中药学科学术带头人。研究方向：中药学教学、中药性能与配伍应用及中药不良反应的研究。

作者简介：赵妮(1988—)，女，在读硕士研究生。研究方向：中药及复方应用研究。

*基金项目：国家自然科学基金项目（编号81360633）。

收稿日期：2015-07-20

［中图分类号］R284.2

［文献标识码］A

［文章编号］1004-6852(2016)02-0034-03