李 亮 ，姬艳苏

1天津医科大学总医院，天津 300052；2武警后勤学院附属医院

黄芪是临床用于治疗心力衰竭的常用中药，黄芪皂苷是黄芪强心的主要成分，也是许多抗心力衰竭中成药的重要组成［1］。酪氨酸激酶2/信号传导及转录激活因子3（Janus activated kinase2/signal transducer and activator of transcription3，JAK2/STAT3）广泛参与血管生成与细胞增殖、分化和迁移［2］。既往研究［3-4］发现黄芪总皂苷能增强心肌梗死大鼠左心室的结构和收缩功能，抑制心室重塑。羧基端活性段脑钠肽（B-type natriuretic peptide，BNP）是国际公认的诊断心力衰竭的血清标志物，是心肌损伤高度

敏感和特异的指标，有助于评估心力衰竭的诊断和治疗效果。本研究进一步观察慢性心力衰竭大鼠微血管密度的变化，评价心肌JAK2/STAT3 mRNA和蛋白水平及黄芪总皂苷对JAK2/STAT3的干预作用，探讨黄芪总皂苷抑制心室重塑、促进血管新生的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠70只，雄性，体质量200～220 g，由北京维通利华实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（京），分笼饲养，每笼5只，食、水自由摄取。

1.2 主要仪器与试剂 ABI7300实时荧光定量系统（Applied Biosystems，美国）；DYY-IIIB 电泳仪（北京六一仪器厂）；转膜装置（Bio-Rad，美国）；GENE GENIUS凝胶成像系统（Bio Imaging System，SYNGENE，英国）。大鼠血清B型尿钠肽测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150415）；Trizol Reagent（invitrogen）；Reverse Transcription Reagents Kit；Power SYBR Green PCR Master Mix Reagents Kit（Applied Biosystems，美国）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），小鼠抗大鼠抗体：VⅢ因子（Santa Cruz，美国），JAK2（ab39636，abcam，美国），STAT3（ab68153，abcam，美国），Actin（ab8226，abcam，美国）。黄芪总皂苷，纯度72.7%，由西安开来生物工程有限公司提供（k150411）；卡托普利片（上海施贵宝制药有限公司生产，批号：AAA6059）。

1.3 复制慢性心力衰竭模型及给药方法 大鼠心肌梗死后心力衰竭模型的复制参照文献［3］方法制作，采用结扎大鼠冠状动脉左前降支造成急性心肌缺血后心力衰竭模型，以左心室射血分数（Ejection fraction，EF）＜60%作为模型成功的标准，剔除死亡和未达到心力衰竭标准的大鼠后，将其余模型成功大鼠随机分为模型组、卡托普利50 mg/kg组及黄芪总皂苷10 mg/kg、20 mg/kg剂量组，每组8只，另设假手术组8只。灌服给药，假手术组及模型组灌服等量蒸馏水，1次/d，连续给药4周。

1.4 血清B型钠尿肽前体物（N T-proBN P）含量检测 给药4周后于腹主动脉取血，离心后留取血清，采用ELISA法检测血清NT-proBNP的含量。

1.5 心肌微血管密度（M V D）检测 给药结束后处死动物，取出心脏，取心尖处梗死区边缘部分心肌组织，用石蜡包埋组织块，制作6 μm切片，行特异性VⅢ因子免疫组化染色。在400倍光镜下，每张切片中随机观察3处，行血管计数，血管内皮细胞均被染成黄、褐色，单个内皮细胞、内皮细胞簇、微小血管均予计数。

1.6 心肌BN P、JA K 2和STA T3m RN A表达检测 总RNA的提取：采用Trizol法提取心肌组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度和含量，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。取0.2μgRNA用于反转录。RNA反应体系为10×RT Buffer 1.0 μL，MgCl2（25 mmol）2.2 μL，deoxy NTPs Mixture（2.5 mmol）2.0 μL，Random Hexamers（50 μmol）0.5 μL，RNase Inhibitor（20 U/L）0.2 μL，Multi Scribe Reverse Transcriptase（50 U/ μL）0.25 μL。混合以上反应物，离心后的0.2 μg RNA用RNase-free water补足反应体系至 10 μL。反应条件：25℃ 10min，48℃30分钟，95℃5分钟。PCR反应体系为2×Master Mix 12.5 μL，Forward Primer 0.5 μL（200 nm/L），Reverse Primer 0.5 μL（200 nm/L），cDNA Sample 0.5 μL，RNase-freewater11μL，反应体系为 25μL。混合以上反应物，开始扩增，扩增条件为95℃预变性10分钟，95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。反应结束后使用ABI7300实时荧光定量系统分析PCR过程中各检测样本的域值循环（threshold cycle，CT）数值，通过2-△△CT表示目的基因相对于β-actin的表达水平。引物序列如下：

1.7 心肌JA K 2和STA T3蛋白表达检测 应用蛋白免疫印迹（Western-blot）技术检测 JAK2和STAT3蛋白表达，提取心肌组织总蛋白，取1 μL蛋白质溶液，二联喹啉酸（BCA）法进行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，电泳完毕将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，TBST洗膜，将聚偏二氟乙唏膜（PVDF）加入封闭液中，常温摇动，封闭结束，加1 mL的JAK2和STAT3 单克隆抗体（1∶1000 稀释），4℃过夜，弃去反应液，TBST清洗3次，10 min/次。在膜上加入荧光标记的二抗（1∶20 000稀释），室温下轻轻振荡1小时后取出膜，在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中清洗3次，10 min/次。二抗孵育后在暗室内进行显影和定影，标定蛋白marker，用凝胶成像系统分析与扫描。

1.8 统计学方法 使用SPSS 19.5统计软件分析数据，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表达 造模后5周，心肌梗死大鼠EF值为（53.9±4.9）%，＜60%，与假手术组 EF 值（84.7±5.4）%比较差异有统计学意义，证明模型复制成功。与假手术组相比，慢性心力衰竭大鼠血浆NT-proBNP含量和心肌BNP mRNA水平均增加（P＜0.05），黄芪总皂苷各剂量组和卡托普利50 mg/kg组可降低血浆NT-proBNP含量，并下调心肌BNP mRNA表达（P＜0.05）；卡托普利、黄芪总皂苷各给药组间各指标比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表达（±s）

表1 各组大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表达（±s）

注：与假手术组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01;与模型组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

组别 只数 M V D N T-proBN P含量/（pg·m L-1） BN P m RN A表达假手术组 8 - 637.57±44.65 1.04±0.29模型组 8 9.86±3.44 706.17±34.56* 2.01±0.55**黄芪总皂苷10m g/kg组 8 14.43±3.41# 670.00±47.14 0.92±0.34黄芪总皂苷20m g/kg组 8 15.14±4.34# 630.86±58.69# 1.08±0.33##卡托普利50m g/kg组 8 15.29±4.03# 639.86±37.31# 0.97±0.37##

2.2 各组大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表达 各组取6只大鼠进行比较。与假手术组比较，模型组大鼠心肌JAK2 mRNA表达升高而STAT3 mRNA和蛋白表达降低（P＜0.05）。黄芪总皂苷20 mg/kg剂量组及卡托普利组可下调JAK2 mRNA表达，上调STAT3 mRNA表达，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组STAT3蛋白表达降低了50.7%（P＜0.01），黄芪总皂苷20 mg/kg剂量组能上调STAT3的蛋白水平，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠心肌JAK2的蛋白表达较假手术组有升高趋势，而各给药组均有下调JAK2蛋白水平的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2、图 1。

表2 各组大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表达（±s）

表2 各组大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表达（±s）

注：与假手术组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01;与模型组比较，#表示P＜0.05

组别 只数 JA K 2 STA T3 m RN A 蛋白 m RN A 蛋白假手术组 6 1.06±0.33 0.18±0.06 1.02±0.18 0.71±0.18模型组 6 1.61±0.58* 0.25±0.09 0.75±0.09** 0.35±0.13**黄芪总皂苷10 m g/kg组 6 1.45±0.36 0.21±0.08 0.62±0.13 0.31±0.05黄芪总皂苷20 m g/kg组 6 1.16±0.21# 0.20±0.07 0.83±0.21# 0.63±0.20#卡托普利50 m g/kg组 6 1.20±0.28# 0.20±0.08 0.91±0.20# 0.46±0.13

图1 黄芪总皂苷对心肌梗死后心力衰竭大鼠JA K 2和STA T3蛋白表达的影响

3 讨论

BNP是由心房和心室产生的一种肽类激素，心肌细胞首先合成BNP原，称为proBNP，proBNP在蛋白酶的作用下裂解为NT-proBNP和生物活性激素BNP。两种多肽等摩尔分泌并释放入血循环，由于BNP的半衰期为22分钟，而NT-proBNP的半衰期为120分钟，而且体外稳定时间长达24小时，结合动物实验取材和检测时间，通过检测血清中较稳定的NT-proBNP含量和心肌组织BNP的基因表达水平综合评价BNP的变化情况。心力衰竭时BNP主要由心室细胞分泌，其合成与分泌主要受室壁张力调节，心力衰竭患者在循环容量超负荷时常合并左心室或全心扩大，引起室壁张力增加，BNP被大量合成并释放入血，血中浓度明显增高，能直接反映心功能损伤或衰竭状态［5］。本研究发现心力衰竭大鼠血清NT-proBNP含量升高，BNP及基因表达上调，本课题组前期研究发现慢性心力衰竭大鼠左心室内径和容积明显增加，相应的室壁张力增强，而黄芪总皂苷可抑制心室重塑［3］，减小室壁张力并降低血清BNP浓度，证明黄芪总皂苷对慢性心力衰竭的治疗效果。

心肌梗死后的血管新生是指将血管新生诱导因子转入组织中，诱导缺血区侧支毛细血管新生，改善缺血部位血供。应用药物促进微血管新生，促进侧支循环形成，完成缺血区血管的自我重建，是治疗缺血性心脏病的有效手段。JAK2/STAT3通路是诱导血管内皮生长因子（VEGF）生成与迁移的关键环节，JAK2调控血管生成与细胞增殖、分化和迁移；STAT3是JAK2的重要底物，STAT3缺失时心肌毛细血管密度减少，梗死面积较正常增大，心脏功能受限，生存率下降。相反，STAT3过表达的大鼠梗死心脏中毛细血管密度增加，VEGF表达增加，梗死面积较野生型小［6］。STAT3的蛋白水平和活性的提高对早期和后期心肌缺血有保护作用，能调控在体心肌血管生长，有助于心脏适应各种应激［2］。

黄芪总皂苷是黄芪的主要活性成分，其通过调节一氧化碳保护内皮细胞，促进内皮细胞的迁移和管腔形成，利于心肌缺血区血管数目的增加［7］。本课题组前期研究发现黄芪皂苷能增强心肌梗死大鼠的心脏收缩和舒张功能，抑制心室重塑，本研究中黄芪总皂苷对心力衰竭标志物BNP在基因和血清学水平方面都有明显改善作用，在mRNA和蛋白水平对JAK2/STAT3通路有干预作用，提示黄芪总皂苷促进治疗性血管新生可能与调节JAK2/STAT3通路有关。本研究为黄芪总皂苷促进心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌血管新生的作用机制进行了初步探讨，但关于黄芪总皂苷对心肌梗死后不同阶段心肌血管新生的促进作用与途径尚未明确，仍需进一步研究与探索。