玄参配方颗粒制备工艺及质量标准研究*

许洪波，黎彦宏，蔡兴航，杨 康，陈素芸，冀 春，刘乃尧，唐志书△

1 陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳712083；2 西安市第一医院；3 西安市中医医院

中药玄参Radix Scrophulariae 为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄参具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结之功效，常用于热病伤阴、温毒发斑、舌绛烦渴、津伤便秘、骨蒸劳嗽、咽痛、目赤等症的治疗［1］。玄参主要含有糖类、环烯醚萜、苯丙素、萜类、苯酚、甾醇、黄酮等化学成分［2］，其中，由于玄参含有大量糖类，因此在贮存过程中更容易吸潮、霉变和生虫［3］。中药配方颗粒是采用现代科学技术将中药饮片经提取、浓缩、干燥制成颗粒剂，具有服用简单，便于携带，利于储存等特点［4-7］。广西壮族自治区和广东等省份分别颁布了玄参配方颗粒的质量标准，一定程度上为玄参配方颗粒的使用和监管提供了依据，但至今没有形成统一可控的国家标准或行业标准，尤为重要［8-9］。此前，周小雅等［10］采用紫外-高效液相色谱（ultraviolet-highperformance liquid chromatography，UV-HPLC）双波长法同时测定了玄参配方颗粒中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸3 种成分的含量。徐圣秋等［11］采用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定了玄参配方颗粒中哈巴俄苷的量。钮正睿等［3］用HPLC测定了玄参配方颗粒中哈巴俄苷和肉桂酸的含量。这些研究多针对玄参配方颗粒中的一种或多种成分的含量进行测定，未涉及其薄层色谱鉴别。本研究对玄参配方颗粒制备提取工艺进行优化，并在此基础上制备配方颗粒，建立薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）定性鉴别方法和HPLC 含量测定方法，以期为形成统一的玄参配方颗粒质量标准提供参考。

1 材料与仪器

1.1 仪器HT-2109 型电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司），EYELA N-1100 旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社），Zirbus-Vaco5 冷冻干燥机（德国Zirbus科技），岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津），KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），CPA2250 型电子天平（赛多利斯公司，读数精度0.01 mg）。

1.2 药物及试剂实验用玄参饮片购自亳州药材市场，经陕西中医药大学王薇教授鉴别，同时按照《中华人民共和国药典》2015 版一部玄参项下薄层鉴别方法进行鉴定，为玄参科植物玄参（Scrophularia ningpoensisHemsl.）的干燥根。色谱纯乙腈（德国默克公司，批号：I38579）；哈巴苷（含量96.8%，批号：111729-201707）和哈巴俄苷对照品（含量95.9%，批号：111730-201709）及玄参对照药材均购自中国食品药品检定研究院；其余试剂均为分析纯，实验用水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 正交试验设计 玄参的传统用药方式多为汤剂，因此，本研究使用水作为提取溶媒。国家药典委员会在2016 年公布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》中将出膏率作为配方颗粒制备中的重要参数，因此，本实验以出膏率为指标，采用正交试验设计对提取过程中三个主要因素（提取时间、提取次数和料液比）进行考察，试验选用L9（34）正交表，见表1。

2.1.2 正交试验方法及结果 分别称取9 份玄参饮片，每份50 g，先用纯净水浸泡30 min，之后按照L9（34）正交表安排试验，A列为空白列。实验所得提取液趁热滤过，减压浓缩至适量，经冷冻干燥后，计算出膏量。由极差分析结果可知：3 个因素对玄参出膏量影响程度为：提取次数＞提取时间＞料液比；方差分析结果表明：提取次数对结果的影响显着，提取时间和料液比影响不显着；因此，基于节约成本考虑，因素A和B均取最小值，即A1、B1，最终确定的提取工艺为：A1B1C3，即玄参饮片用水煎煮3次，每次30 min，3次煎煮分别加入10、8和8倍量水。见表2—3。

表1 玄参提取工艺正交试验因素及水平

表2 正交试验结果及极差分析

表3 正交试验方差分析

2.2 玄参配方颗粒制备取干燥的玄参饮片1500 g，浸泡30 min，按照正交试验确定的最佳工艺进行提取，滤过，合并滤液，进行适当浓缩，加入相当于固体含量20% 的糊精，在进风口温度110 ℃进行喷雾干燥，得到浸膏粉，按照m浸膏粉∶m糊精=1∶0.7 均匀混合，用95%的乙醇制成软材，过1号筛制粒，70℃烘箱干燥3 h后，取出用1号筛和5号筛双筛分取即得。

2.3 玄参配方颗粒TLC鉴别

2.3.1 对照品溶液的制备 分别取哈巴苷、哈巴俄苷适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.3.2 对照药材溶液的制备 按照2015 版《中华人民共和国药典》中玄参［鉴别］（2）项下方法制备玄参对照药材溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取配方颗粒1 g，研细，加水25 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。

2.3.4 薄层鉴别 用毛细管分别吸取适量对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（8∶2∶0.2）为展开剂，展开至薄层板前沿后取出，晾干，在254 nm紫外光下检视，之后喷以10%硫酸-乙醇溶液，电炉加热至斑点显色清晰。由图1 可知，供试品色谱中，在与玄参对照药材及对照品色谱相应的位置，显相同颜色的斑点。

图1 玄参配方颗粒薄层鉴别色谱图

2.4 玄参配方颗粒HPLC含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5 μm），以0.03%磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～10 min，3%～10%B；10～20 min，10%～33%B；20～25 min，33%～50% B；25～30 min，50%～80% B；30～35 min，80%B；35～37 min，80%～3% B；流速为1.0 mL/min，检测波长210 nm，柱温25℃，进样量10 μL。在此条件下，供试品溶液中的哈巴苷和哈巴俄苷分离良好，其他成份及辅料无干扰。见图2。

图2 玄参配方颗粒HPLC图

2.4.2 对照品溶液制备 分别取哈巴苷和哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加30%甲醇制成每1 mL含哈巴苷89.06 μg、哈巴俄苷48.05 μg 的溶液，即得混合对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取玄参配方颗粒约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，浸泡1 h，超声处理30 min放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 m滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系考察 精密吸取“2.4.2”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按“2.4.1”方法进样，分别测定哈巴苷和哈巴俄苷的峰面积，以浓度（μg/mL）为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得哈巴苷回归方程为Y=3383.013X+1776.889，R2=1.0000，线性范围8.91～89.06 μg/mL；哈巴俄苷回归方程为Y=19457X+10793.11，R2=0.9999，线性范围4.81～48.05 μg/mL。

2.4.5 方法学考察

2.4.5.1 精密度试验 取同一份供试品溶液，按“2.4.1”色谱条件重复测定6 次，计算哈巴苷和哈巴俄苷峰面积的RSD 分别为1.03%和0.48%。表明仪器精密度良好。

2.4.5.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在第0、2、4、8、12、24 h测定，计算哈巴苷和哈巴俄苷峰面积的RSD 分别为1.92%和0.91%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5.3 重复性试验 按照“2.4.3”方法平行制备6 份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算哈巴苷和哈巴俄苷峰面积的RSD 分别为1.36%和1.95%。表明建立的方法重复性良好。

2.4.5.4 加样回收试验 取已知含量的玄参配方颗粒6 份，精密称定，根据配方颗粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量按1∶1添加各对照品，平行制备6份供试品溶液，按“2.4.1”方法测定。计算供试品溶液中哈巴苷和哈巴俄苷平均加样回收率分别为102.47%和97.78%，RSD 分别为1.88%和2.70%，表明该方法的准确度良好。

2.4.6 样品测定 根据建立的色谱方法，对3 批自制和1 批市售玄参配方颗粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量进行测定。见表4。

表4 玄参配方颗粒含量测定 %

3 讨论

哈巴苷和哈巴俄苷是玄参中的2 个主要环烯醚萜苷类成分，有研究表明：哈巴俄苷能使阴虚小鼠抑制的免疫功能恢复；哈巴苷、哈巴俄苷均能促进阴虚小鼠体外脾淋巴细胞增殖［11］，具有镇痛、抗炎等作用，与玄参滋阴和抗炎功效密切相关［12-13］；因此，哈巴苷和哈巴俄苷被认为是玄参特征性成分。2015 年版《中华人民共和国药典》就以哈巴苷和哈巴俄苷的含量作为玄参药材的质量控制标准。本研究以玄参特征性成分哈巴苷和哈巴俄苷含量作为指标，能更加全面的反映玄参配方颗粒的质量。

目前，有关玄参配方颗粒的文献报道中，尚没有对其TLC 定性鉴别进行探讨，本研究构建了玄参配方颗粒的TLC 定性鉴别方法。针对玄参配方颗粒所含糖苷类化合物较多的特点，研究中反复比较了石油醚-丙酮-甲酸、氯仿-丙酮-甲酸、氯仿-甲醇-甲酸等多种加酸或不加酸的展开体系，最后发现以氯仿-甲醇-水为展开剂效果较好。关于展开剂的配比，最后确定氯仿-甲醇-水的比例为8∶2∶0.2，在该配比下，展开剂可直接配制使用，从而免去了静置分液的程序，而且主要斑点的比移值适中。总之，该方法简便，重复性好，能快速有效控制玄参配方颗粒的质量。