孟宪琦，岳 鑫，王晓琴

内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110

猫头刺又名鬼见愁、老虎爪子，为豆科棘豆属猫头刺（Oxytropis aciphyllaLedeb.）的全草，矮小半灌木，是蒙古高原荒漠化草原区的特征物种，生于海拔1000～3250 m的砾石质平原、薄层沙地、丘陵坡地及砂荒地上，分布于内蒙古、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省区［1］。茎叶捣碎煮汁可治脓疮［2-3］。

棘豆属植物全世界有300 多种，我国分布有150 多种。该属植物化学成分类型多样，包括黄酮类、皂苷类、生物碱、木脂素、酚酸类等［4-5］。许多植物具有显着的药理活性，在民间，尤其是在蒙药和藏药中有着悠久的使用历史。棘豆属植物的国内外研究较多，但关于这一荒漠草原建群植物猫头刺的药学研究国内外较罕见［6-7］。已有的研究表明黄酮类成分是棘豆属药用植物的主要活性成分［8-11］，本实验通过盐酸镁粉显色反应初步确定猫头刺中含有黄酮类化合物，因此本研究首次对猫头刺的总黄酮提取条件进行优选，并建立了紫外分光光度法测定其总黄酮含量的有效方法，期望为猫头刺药材进一步的研究和开发利用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器AL-204 型分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；UVmini-1280 型紫外可见分光光度计［岛津仪器（苏州）有限公司］；KQ-500E超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；SB-1300型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）。

1.2 试剂与药材实验用的4 批猫头刺药材均在内蒙古地区采集，阴干，经由内蒙古医科大学渠弼教授鉴定为猫头刺Oxytropis aciphyllaLedeb.的干燥全草，本研究建立含量测定方法和黄酮单因素实验考察所用药材均为4 号样品。芹菜素标准品（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20981）；三乙胺（天津市津东天正精细化学试剂厂，乙醇（天津市津东天正精细化学试剂厂）；甲醇（天津市津东天正精细化学试剂厂），以上试剂均为分析纯；实验用水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备取干燥至恒重的芹菜素对照品5 mg，精密称定，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度。精密吸取0.5 mL 溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得50 μg/mL的芹菜素对照品溶液，贮藏于4℃冰箱备用。

2.2 供试品溶液的制备取干燥的猫头刺药材粉末（粉碎过4号筛）0.2 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加50%乙醇25 mL，超声提取40 min，摇匀，并过滤，取续滤液，即得。

2.3 三乙胺显色法和测定波长的选择取供试品溶液和对照品溶液各1 mL，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇1 mL，加1%三乙胺溶液定容至刻度，以随行试剂为空白对照，在200～800 nm波长范围内进行扫描。结果表明对照品溶液与供试品溶液均在395 nm处有最大吸收，且干扰较小，故选择395 nm作为测定波长，见图1。

图1 紫外吸收光谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线绘制 精密吸取芹菜素对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，按“2.3”项下的方法显色后，在395 nm 处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程Y=0.1139X-0.0119（r=0.9999）。芹菜素在2.5～15.0 μg/mL 范围内与A值呈良好的线性关系，见图2。

2.4.2 精密度试验 取猫头刺药材粉末0.2 g，精密称定，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的方法显色后，以显色剂为空白，在395 nm 处测定吸光度A，重复操作6 次，结果测得供试品溶液吸光度A 的RSD 为0.24%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取猫头刺药材粉末0.2 g，精密称定，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别于10、20、30、40、50、60、90 min 内按“2.3”项下的方法显色，以显色剂为空白，在395 nm处测定吸光度A，计算总黄酮平均含量的RSD为0.61%，表明样品溶液在90 min内较稳定。

2.4.4 重复性试验 取猫头刺药材粉末0.2 g，共6 份，精密称定，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的方法显色后，以显色剂为空白，在395 nm 处测定吸光度A，计算总黄酮平均含量的RSD为0.43%，表明本实验采用的实验方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率 试验取已知含量的猫头刺药材粉末9 份（n=3），各约0.1 g，精密称定，分别按已知总黄酮含量的80%、100%、120% 3 个水平加入芹菜素对照品溶液，按“2.2”项下方法制备，按“2.3”项下的方法显色后，以显色剂为空白，在395 nm 处测定吸光度，计算平均回收率和RSD，结果见表1。

2.5 总黄酮提取条件单因素考察

2.5.1 提取溶剂 筛选取猫头刺药材粉末约1.0 g，9 份，精密称定，置于 50 mL 具塞锥形瓶中，分别以水、30%、50%、70%、100%的甲醇以及 30%、50%、70%、100%的乙醇各 25 mL 为提取溶剂，超声30 min，过滤，取续滤液，按“2.3”项下的方法显色，按“2.4.1”项下标准曲线计算总黄酮含量，依次为 1.890、1.206、1.216、1.703、1.435、1.407、1.905、1.853、0.982 mg/g。结果显示以50%的乙醇为提取溶剂时，总黄酮提取率最高。在此基础上，又筛选了三个水平乙醇浓度40%、50%、60%，结果显示总黄酮含量依次为1.520、1.905、1.891 mg/g，因此选用50%乙醇溶液作为最佳提取溶剂，见图3。

图3 猫头刺总黄酮提取溶剂的考察

2.5.2 提取方法的筛选 取猫头刺药材粉末约1.0 g，2 份，精密称定，置50 mL 圆底烧瓶中，加入25 mL 50%乙醇。1 份加热回流提取30 min，摇匀，并过滤；另1 份超声30 min，摇匀，并过滤。按“2.3”项下的方法显色，按“2.4.1”项下标准曲线计算总黄酮含量。结果显示回流提取效果略好，但两种提取方法测得含量相差不大，考虑操作简便快捷，所以确定提取方法为超声提取。

2.5.3 浸泡时间的筛选 取猫头刺药材粉末约1.0 g，4 份，精密称定，加入 25 mL 50%乙醇后，浸泡时间分别为0、30、60、90 min，超声提取30 min，摇匀，并过滤。按“2.3”项下的方法显色，按“2.4.1”项下标准曲线计算总黄酮含量，依次为2.362、2.206、2.246、2.097 mg/g。结果显示，样品不浸泡时，总黄酮含量测定值最高，见图4。

图4 猫头刺总黄酮浸泡时间的考察

2.5.4 提取时间的筛选 取猫头刺药材粉末约1.0 g，5 份，精密称定，加入25 mL 50%乙醇后，分别超声提取20、30、40、50、60 min，摇匀，并过滤。按“2.3”项下的方法显色，按“2.4.1”项下标准曲线计算总黄酮平均含量，依次为2.030、1.977、2.104、2.036、1.998 mg/g，结果显示，提取时间为40 min 时，样品溶液总黄酮含量测定值最高，见图5。

图5 猫头刺总黄酮超声时间的考察

2.5.5 取样量的筛选 分别取猫头刺粉末约0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g，精密称定，加入25 mL 的50%乙醇，超声40 min，摇匀，并过滤。按“2.3”项下的方法显色，按“2.4.1”项下标准曲线计算总黄酮平均含量，依次为2.446、2.260、1.917、2.050、2.104 mg/g，结果显示当取样量约为0.2 g 时，总黄酮含量测定值最高。

2.6 猫头刺药材总黄酮的含量测定取0.2 g不同产地的样品各3 份，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的方法显色后，以显色剂为空白，在395 nm 处测定吸光度A，计算不同产地的猫头刺总黄酮的平均含量，见表2。

表2 猫头刺总黄酮的含量

3 讨论

本实验分别考察直接测定法、三氯化铝显色法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色法和三乙胺显色法，对于测定猫头刺总黄酮的适用性，结果表明样品溶液与对照品溶液经三乙胺显色法显色后均在395 nm处有最大吸收且吸收峰明显，无杂峰干扰，因此本实验将三乙胺显色法确定为测定猫头刺总黄酮含量的显色方法。三乙胺显色法的原理是当黄酮类化合物的羟基解离时，可以和三乙胺进行稳定的结合，从而进行检测，此显色方法的专属性和准确性均较高［12-13］。

本实验首次建立了采用紫外分光光度法测定猫头刺总黄酮含量方法，操作方法简便，结果准确度高，实验方法重现性较高；并且初步探索了猫头刺总黄酮的提取条件，对其提取条件进行优化。猫头刺为季节性有毒植物，具有药用价值，目前对其化学成分研究鲜见报道，期望本研究结果可以为其资源开发与利用提供可靠的参考。