牛素生，杜梦凡，刘俊宁，张 燕，赵常云蕾，黄茂畅，郭 双
（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122；3.南方医科大学中西医结合医院，广东 广州 510315；4.黄冈市妇幼保健院，湖北 黄冈 438000）
骨折是骨伤科最常见的临床病症，愈合过程漫长而复杂，容易受多种因素的影响。骨折愈合模型研究多用大鼠，其胫骨和股骨属于长骨，常用来作为骨折的模型，其中股骨是更理想的骨折模型［1］，常用的制作方法有开放截骨模型和闭合骨折模型。开放截骨模型在国内应用较多［2-4］，但内固定时对膝关节造成干扰［5］，造成股骨骨折的方法有暴力打击［6-7］和线锯［8-9］或摆锯锯断［10-12］，切口约需3 cm［9］，创伤大，出血多。固定方式选择上也存在较大差异［7，10，13-14］，导致股骨骨折和固定方式缺乏统一的标准，模型均一性差。本研究先对大鼠股骨相关解剖参数进行研究，显露股骨后用低速电锯截断造成股骨骨折，再结合传统中医正骨复位手法，采用克氏针进行髓内固定，建立大鼠股骨骨折髓内钉内固定模型，为骨折愈合的相关研究提供实验依据。
1 实验材料
1.1 实验动物 3 月龄SPF 级SD 雌性大鼠18 只，体质量（170±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2020-0049，饲养于福建中医药大学医学实验动物中心，许可证号：SYXK（闽）2019-0007。单笼5 只饲养，自由饮水与进食（标准SPF 饲料），室温20～25 ℃，相对湿度45%，12 h 光照/12 h 黑暗。实验方案通过福建中医药大学动物伦理委员会审查并获得批准（FJTCM IACUC 2020032）。
1.2 器械及材料 A071008 微型电钻（安徽阿斯珈工具有限公司）；微型锯片（阿斯珈 圆形，Φ2 cm，厚度0.1 mm）、持针器、缝合针、克氏针（天津市宇通医疗器械厂）；310-1FA/9 读数显微镜（长春市第三光学仪器厂）；DL92150P 游标卡尺（得力集团有限公司）；小动物X 线机（美国Kubtec 公司）；TreadScan步态分析系统（美国CleverSys公司）。
2 方法与结果
2.1 股骨解剖参数测量 取8 只SD 大鼠，2%戊巴比妥钠按40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，游离双侧股骨，其中左侧股骨用于股骨长度和髓腔有效长度的测量。测量时用游标卡尺测量股骨大转子顶点至股骨髁平面的距离即为股骨长度，再用薄锯片将大鼠股骨沿矢状位纵行剖开，用克氏针顶端将干骺端髓内松质骨尽量推挤，直至无法移动后用游标卡尺测量其髓腔长度。右侧股骨分别用电锯片自中点、中上1/3 交界和中下1/3 交界处横行切断，观察髓腔形态，并以短轴为准用读数显微镜测量内径。
结果显示，股骨中点髓腔横断面形态近似椭圆形，远端横断面近似长方形，近端横断面近似三角形，矢状位观察大鼠股骨髓腔稍呈弧形。大鼠股骨全长为（36.40±0.22）mm，髓腔的有效长度为（23.59±0.17）mm，股骨髓腔的近1/3、中点和远1/3 依次为（1.64±0.15）、（1.60±0.21）、（1.94±0.33）mm。基于此，后续内固定选取直径1.5 mm、长度21 mm 的克氏针内固定。
2.2 骨折髓内固定模型建立 另取3 月龄SD 雌性大鼠10 只，2%戊巴比妥钠水溶液按40 mg/kg 腹腔注射麻醉后取俯卧位，双下肢呈蛙式位固定放置，剃除毛发。
2.2.1 显露股骨 用手触摸股骨远近端（膝关节和髋关节）和股骨走行并做标记，以股骨中点为中心沿股骨走行做一约0.6 cm 斜形切口深至筋膜层（见图1A），可见股外侧肌和股二头肌外侧之间隙白色深筋膜间隔，沿肌间隙分离直至股骨表面，用手术刀片沿股骨表面纵行切开骨膜，再用2 把弯头眼科镊紧贴股骨表面分离骨膜并置于股骨两侧，捏紧镊子后以股骨中点为中心向远近端纵行剥离骨膜（见图1B），暴露股骨约0.6 cm，暴露部分的中心位置即为股骨中点。
图1 开放式骨折髓内固定模型建立图
2.2.2 截断股骨 将其中1 把眼科镊弯头向上贴紧骨面置于股骨前侧，另1 把弯头镊于对侧同样操作，将2 把弯头镊向两边撑开，用直径2 cm、厚度0.1 mm 的电动锯片垂直股骨纵轴切割（5 000 r/min，切割时为防止骨骼灼伤，用生理盐水不停滴截骨处）（见图1C），直至股骨横截面的3/4，取下眼科镊，用2 把持针器分别轻轻夹持股骨切割口远近端，同时向同一方向稍用力将股骨掰断，造成股骨横断骨折。
2.2.3 复位固定股骨 2 把持针器继续夹持骨折远近端稍做翻转，将骨折端向外侧成角，根据以上骨髓腔测量数据，选取一直径1.5 mm、长度21 mm 的克氏针，先插入骨折远端骨髓腔，夹持远端骨干的持针器移到裸露的克氏针，一助手用“拔伸牵引”的手法持续牵拉骨折以远的下肢，按骨折复位时“子求母”的原则，采用“折顶”的复位手法，先加大骨折端成角，由骨折远端裸露的克氏针寻找并插入近端骨髓腔，分别握持骨折远近端做纵向推挤（见图1D）。再次显露骨折端检查骨折断端无分离，骨折端稳定，生理盐水冲洗切口后逐层缝合关闭切口。所有大鼠无意外死亡情况发生。
2.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件分析数据。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组内不同时间点比较采用重复测量方差分析，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.4 下肢步态分析 采用TreadScan 步态分析系统分析10 只右侧股骨骨折髓内固定大鼠术后5 h、术后2 周和术后4 周的下肢步态，观察大鼠双侧下肢活动情况。该系统通过高速彩色摄像机以100 帧/s的速度完整捕捉大鼠在透明穿梭跑带上的活动情况，并将捕获的足印传送到对应的运行步态分析系统生成视频文件，将获得的视频在软件内进行两侧足摆动时间、足印长度、足间距、步数和迈步频率等数据进行分析。分析时，先将大鼠随机放置于步态分析系统上适应5 min 后再开始。
与健侧比较，手术侧术后5 h 摆动时间明显延长（P＜0.05），足印长度、足间距均明显缩短（P＜0.05），步数、迈步频率均明显减少（P＜0.05）；术后2 周足印长度明显减小（P＜0.05）；术后4 周双侧下肢步态分析指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与手术侧术后5 h比较，术后2周步数明显减少（P＜0.05）；术后4 周双足摆动时间明显延长（P＜0.05），足印长度明显缩短（P＜0.05），步数明显减少（P＜0.05）。见表1。
表1 双侧大鼠术后不同时间下肢步态分析比较（±s）
表1 双侧大鼠术后不同时间下肢步态分析比较（±s）
注：与健侧比较，1） P＜0.05；与术后5 h 比较，2） P＜0.05。
n 组别迈步频率/Hz 2.28±0.45 1.75±0.33 1.96±0.65 1.80±0.421）1.62±0.30 1.59±0.44健侧10手术侧10时间术后5 h术后2周术后4周术后5 h术后2周术后4周摆动时间/ms 209.68±55.26 336.45±156.70 425.40±131.72 300.30±106.921）335.60±142.73 436.20±165.642）足印长度/mm 32.54±4.06 34.46±4.07 15.86±8.81 24.72±4.261）26.88±3.931）16.82±7.192）足间距/mm 124.15±32.56 99.61±18.10 97.93±27.28 95.82±25.631）102.02±16.09 107.39±23.37步数21.50±4.65 15.90±3.41 16.70±7.54 17.60±2.171）14.40±2.952）14.40±3.632）
2.5 股骨骨折及髓内固定情况观察 下肢步态分析结束后，用2%戊巴比妥钠按40 mg/kg 进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后取俯卧位，用小动物X 线机进行手术侧股骨X 线摄影，观察骨折端对位、固定及愈合情况。
术后X 线摄影显示骨折对位对线情况良好；术后2 周可见骨折端对位对线良好，骨折线存在，骨折周围有少量骨痂生长；术后4 周可见骨折端大量骨痂生长，骨痂通过骨折线，骨折线稍变模糊。见图2。
图2 大鼠骨折髓内固定术后X 线影像图
3 讨 论
在传统的骨折动物模型中，Einhorn 动物骨折造模方法被视为经典，在国外被广泛应用，但因该方法所需器械复杂，国内使用并不多［15］。国内一般以开放截骨模型更为多见，常用的方法有Metineren 法［5］和在此基础上的改良方法，操作时需暴露大鼠膝关节并将髌骨脱位，将内固定物由股骨髁穿入股骨髓腔内直至穿出股骨大转子，然后再用特制的装置击打造成股骨骨折髓内固定模型［6-7］，该方法需暴露膝关节，髓内固定物穿过股骨髁和大转子，对髋、膝关节产生明显影响，且是在内固定物插入髓腔内后再进行击打，股骨发生骨折的同时内固定物也出现相应程度的变形，骨折在一定程度的成角移位状况下愈合，影响模型鼠下肢的功能，也会对骨折愈合产生干扰。有学者将股骨暴露后直接用剪刀剪断股骨［16-17］，此方法容易导致股骨碎裂，后期固定困难且容易发生短缩移位。有文献报道采用持续局部加压方法导致骨折［18］，但对具体操作方法表述不详。本研究在总结以上方案的不足后充分利用局部的解剖条件，仅需做0.6 cm 长切口，从肌肉间隙直接显露股骨，无需切开肌肉，用厚度为0.1 mm 锯片从股骨中点进行截断，对髋、膝关节不造成干扰，该方法导致骨折类型为横形，且锯断股骨干3/4 后将剩余股骨折断，形成锯齿状骨折断面，有助于骨折端对位和内固定后的稳定性，防止骨骼发生短缩或旋转移位。
大鼠股骨细小，钉板系统固定困难，因此股骨骨折模型固定时大多采用髓内固定的方法。但以往髓内固定物选择较为随意，且选择证据不充分，主要有直径为1.0、1.5 mm 的克氏针和5、20 mL 注射器针头等［7，13-14］，也有文献并未明确内固定物的直径［10］。若髓内固定物太粗，无法顺利进行髓内固定；若内固定物过细，则不足以维持骨折断端的稳定性，对骨折愈合产生直接影响。本研究先对大鼠股骨相关参数进行测量，结果显示3 月龄SD 大鼠股骨不同部位髓腔形态有所差别，股骨正中间位置即为股骨髓腔最窄处，所以选用直径1.5 mm、长度21 mm 的克氏针做髓内固定，既能保证顺利插入髓腔，又能同时保证骨折端的有效稳定。
骨折手法整复是中医骨伤科特色治疗方法之一，中医正骨在中医骨伤科的应用广泛，其临床价值已被广泛证实［19-20］。在整复过程中先固定骨折近端，再用骨折远端寻找骨折近端并对合，即“子求母”的原则。这种复位方法对周围软组织的损伤较小，有利于骨折的愈合。“折顶”复位法是针对用拔伸牵引无法纠正骨折重叠移位时采用的特定正骨手法，操作时需先增大骨折端的成角，当骨折远近端皮质已经相顶时，再骤然反折使重叠移位得以矫正，以避免在反复复位过程中产生不必要的损伤［19］。本实验在显露骨折端后，如果采用拔伸牵引的方法强行将骨折端分离，容易过度牵拉导致下肢肌肉和神经的损伤。因此在复位时先将克氏针插入骨折远端髓腔，维持拔伸牵引，用持针器夹持骨折近端和远端裸露的克氏针，先逐渐加大骨折端成角，直视下将克氏针插入骨折近端髓腔后再顺势反折，髓内钉即可顺利插入近端髓腔，有效避免肌肉和神经损伤。
术后下肢步态分析结果显示，手术侧术后5 h摆动时间明显延长，足印长度和足间距明显缩短，步数、迈步频率均明显减少，考虑系术后手术侧疼痛所致。随着时间的推移，手术侧下肢各运动指标均逐渐改善，至术后4 周时，两侧下肢各运动指标比较差异无统计学意义，说明骨折端具有良好的稳定性。X 线片结果也显示骨折端对位对线良好，达到解剖复位，克氏针位于髓腔内位置良好，未造成膝、髋关节的损伤，骨折端逐渐有骨痂生长并越过骨折线，骨折愈合情况良好，提示该模型能够成功建立。
综上，本造模方法是在中医正骨理论指导下完成，具有创伤小、操作简单、模型均一性好、可复制性高等优点，值得推广应用。但由于条件所限，本研究只对3 月龄SD 雌性大鼠股骨相关参数进行研究，对其他品系及月龄的大鼠尚需进一步补充和完善。
