宋捷民，钱旭武，滕 晔，周 尧
(浙江中医药大学，杭州 310053)
临床上寒热错杂证，是病人个体在同一时间既有寒证表现又有热证表现、寒证与热证混杂而成的一类证候群。从转换医学的角度出发，中医动物模型必须以临床应用主，强调从实验室到病床旁的连接。临床上“寒热错杂［1］”证颇多，中医治拟“寒热并用”［2］，如治疗上热下寒证之乌梅丸、治寒热互结中焦证之半夏泻心汤、治表寒里热证之大青龙汤、治少阳经寒热夹杂证之小柴胡汤等。但在中医现代实验动物模型的研究中，“寒热证并见”动物模型的建立尚未见报道。本课题组初次研究并建立中医寒热错杂证动大鼠模型及评价指标，现报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性SD大鼠20只，体质量180～200 g，购自浙江省实验动物中心(许可证号SCXK(浙)2008-0033)。
1.2 试剂与药品
丙硫氧嘧啶片，上海朝晖药业有限公司(批号1304E16);知母(批号 130301)、石膏(批号130201)、番泻叶(批号130305)，浙江中医药大学中药饮片有限公司;安琪高活性干酵母由安琪酵母股份有限公司生产;大鼠甲状腺素(T4)酶联免疫检测试 剂 盒 (货 号 RGB-20259R，LOT20131030、20259R)、三碘甲状腺原氨酸(T3)酶联免疫检测试剂盒，北京瑞格博科技发展公司;SOD酶联免疫检测试剂盒(LOT 201306)、NO酶联免疫检测试剂盒(LOT 201306)、MDA酶联免疫检测试剂盒(LOT 201306)，上海信帆生物科技有限公司。
1.3 仪器
HC-3018高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司;MK3型酶标仪，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;ZJ202-OA型恒温干燥箱(沪食药监械(准)字2005第2400889号)、肛温计，浙江省诸暨市实验仪器厂。
2 方法
2.1 造模及给药
将大鼠随机分为正常组和模型组，每组10只，适应性饲养7 d后，均无异常表现即纳入实验，标记、称重。结合陈小野等［3］和卢德赵等［4］的虚寒证造模方法，每天上午灌胃丙硫氧嘧啶100 mg·kg－1，灌胃30 min后放入4℃冰柜中冷冻6 h。下午灌胃100%知母石膏水煎液(知母石膏比例为3∶4)4 mL，第26天起加番泻叶，空白组灌胃等量生理盐水。大鼠灌胃共4周，期间各组正常饮水，第29天皮下注射20%干酵母混悬液［5］，使大鼠发热，造“寒热并见”动物模型。于注射干酵母10 h后，收集模型组与正常组每只大鼠的大便少许，称量。于注射干酵母13 h后眼眶取血1mL，检测 T3、T4、NO、MDA、SOD。
2.2 记录及观察
每天上午灌胃前测量大鼠体温，并观察大鼠一般状态，记录大鼠形态、毛发、爪甲颜色、生活习性、粪便状态等，一直观察到第4周(28 d)。第29天，大鼠皮下注射干酵母混悬液后，每小时测量1次体温。
2.3 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析及t检验进行分析。
3 结果
3.1 一般状态观察
第1周2组大鼠一般状态基本无差别，第2周模型组大鼠比正常组活动减少，开始出现毛发无泽、爪甲颜色变浅、体质量下降、大便较软现象。第3周模型组大鼠出现大便稀软、弓背蜷缩、爱扎堆、懒动嗜卧、行动迟缓无力、形体消瘦、尾巴变凉、毛发枯槁无华。第4周模型组大鼠上述状态较第3周更甚。尤其第26天起加灌番泻叶后，排不成型含大量水和黏液的稀便。这些均符合中医虚寒证动物模型表现。
3.2 各组体质量比较
表1显示，正常组大鼠体质量持续上升，模型组大鼠体质量前3周上升，后1周相继下降，且造模1周即与正常组间比较差异无统计学意义。
3.3 给药后28 d大鼠肛温变化
表2显示，模型组大鼠肛温从第1周开始出现下降，至第2周后与正常组比较差异有统计学意义，且平均体温一直比正常组低1℃以上，基础体温低下是寒证模型的主要指标变化。
表1 大鼠体质量比较(±s，g)
表1 大鼠体质量比较(±s，g)
注:与正常组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01
组 别 例数0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常组 10 204.7±5.33 256.8± 9.22 284.4± 9.97 315.4±12.38 336.5±15.33模型组 10 205.2±4.08 241.1±11.12* 251.7±13.72＊＊ 256.7±12.14＊＊ 239.9± 8.37＊＊
表2 28 d 大鼠肛温变化表(±s，℃)
表2 28 d 大鼠肛温变化表(±s，℃)
注:与正常组比较:＊＊P＜0.01
组 别 例数0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常组 10 38.00±0.16 38.05±0.17 37.79±0.20 37.47±0.24 37.68±0.22模型组 10 37.94±0.21 37.48±0.19＊＊ 37.25±0.13＊＊ 36.88±0.14＊＊ 36.52±0.16＊＊
3.4 注射干酵母混悬液后，造“寒热并见”大鼠模型期间96 h肛温变化
表3显示，寒热并见组造模开始时平均基础体温低下，比正常组低1.5℃左右，在37℃上下，发热造模后第8小时寒热并见组体温升至39℃，上升2℃，以后40个 h之内一直发热，体温在37.8℃至39℃内波动。第48小时后寒热并见组体温逐渐下降，第96小时体温36.7℃，比正常组低1.1℃左右。
表3 模型组大鼠注射干酵母后2组大鼠肛温比较
3.5 大便含水量变化
表4显示，大鼠发热后，收集模型组与正常组每只大鼠大便少许，称量。再将每只大鼠的大便置于烘箱内干燥至恒重，称量、记录、计算含水量。模型组排不成型含大量水和黏液的稀便，与正常组间比较差异有统计学意义。大便含水量=(湿大便重量－干燥后重量)/湿大便重量。
表4 大便含水量比较(±s)
表4 大便含水量比较(±s)
注:与正常组比较:＊＊P＜0.05
组 别 例数 含水量正常组10 0.85±0.04模型组 10 0.60±0.050＊＊
3.6 发热后大鼠血清T3、T4含量的变化
表5显示，注射干酵母13 h后，模型组与正常组眼眶取血1 ml检测T3、T4。实验表明，大鼠发热后，寒热并见组大鼠T3、T4含量下降，与正常组比较差异有统计学意义。
表5 血清T3、T4含量比较(±s)
表5 血清T3、T4含量比较(±s)
注:与正常组比较:＊＊P＜0.05
组 别 例数 T3/(nmol·L－1)T4/(nmol·L－1)10 1697.73±113.54 30.39±2.21模型组 10 1156.28± 5.97＊＊ 22.15±0.77正常组＊＊
3.7 发热后大鼠血清NO、MDA、SOD含量的变化
表6显示，注射干酵母13 h后，模型组与正常组眼眶取血1 mL检测NO、MDA、SOD。实验表明，大鼠发热后，模型组大鼠NO、MDA、SOD含量下降，与正常组比较差异有统计学意义。
4 讨论
表6 血清NO、MDA、SOD含量(±s)
表6 血清NO、MDA、SOD含量(±s)
注:与正常组比较:*P＜0.01，＊＊P＜0.05
组 别 例数 NO(μmo l·L －1)MDA(nmo l·L－1)SOD(U·m L－1)10 30.00±5.00 12.04±0.98 74.68±16.34模型组 10 22.00±5.17* 10.68±1.78＊＊ 57.09± 9.53正常组*
临床上寒热错杂证，是病人个体在同一时间既有寒证又有热证表现、寒证与热证混杂而成的一类证候群。但在同一动物体上同时建立既有寒证又有热证的中医病证模型是很困难的。前期实验我们尝试建立心阳虚寒+胃热、肾阳虚寒+胃热、肝火+胃寒等多种寒热复合模型，最后结果或是单一寒证模型或是单一热证模型，或是寒象热象都不明显，或是死亡率极高。总结经验后我们认为，“寒热错杂”动物模型的建立，最大的阻碍是寒热致病因素的对立性。在动物模型的建立过程中，寒热因素可产生相互抵消、相互中和、相互损伤的作用，而如何减少寒热因素相互抵消是建立寒热错杂证的关键。
若秋等［6］分析寒热错杂证所现症状、体征共117个，主要是胃肠症状群与外部外征。认为寒热错杂证的出现可能是以机体功能状态低下为前体，虚损症是寒热错杂证的重要表现之一。我们以临床常见的脾胃虚寒又感风热，形成表热里寒证之发热、头痛、咽喉肿痛、大便溏泄、四肢不温为模板，采用丙硫氧嘧啶和寒凉中药石膏、知母、番泻叶长时间灌胃的方法，加上冰柜中冷冻等多因素复合造模法制作虚寒证模型。在此基础上，皮下注射干酵母混悬液致大鼠发热，造成约40 h左右的“寒热证并见”动物模型。此动物模型以虚寒为本、表热为标，表热难以影响虚寒之本，寒热因素相互抵消较少，较成功地研究复制出中医寒热错杂证大鼠模型。“寒热并见”动物模型造模后，寒热症状诊断标准的建立与评价是很重要的。
4.1 体温
体温的高低是首要评价标准，本实验模型组大鼠肛温下降，7 d后与正常组比较差异有统计学意义。直至第28天，平均体温一直比正常组低1℃以上，证明虚寒证模型已建立。注射干酵母混悬液后8 h模型组体温升至39℃，以后40 h之内体温在37.8℃至39℃内波动，这表明模型组在虚寒证基础上发热并出现热证。第48小时后出现寒热并见模型组的体温逐渐下降，第96小时体温36.7℃，比正常组低1.1℃左右。这一点说明40 h寒热错杂模型结束后，模型组体温又回归原本虚寒证的状态。
4.2 大便
同一动物不可能同时有高低2个体温，寒热错杂模型组出现发热和寒证指标只能从体温以外指标中寻求。本实验根据虚寒证多便溏的临床特点，在大鼠发热后收集每只大鼠的大便计算含水量。结果模型组排不成型含大量水和黏液的稀便，与正常组比较含水量差异有统计学意义。实验证明，大鼠发热同时呈现出虚寒证便溏的疾病症状，并可以量化检测。
4.3 实验室指标
因为大鼠不可能与人直接交流，人与大鼠很多症状表现存在差异，单纯从症状诊断评价动物模型存在局限性。因此，实验室指标的建立是评价“寒热错杂”动物模型的重点。李敏等［7］研究发现，虚寒状态下大鼠甲状腺激素T3、T4水平降低。薛春苗等［8］将甲状腺轴(T3和/或T4)作为虚寒模型Ⅰ级指标，Ⅰ级指标在虚寒模型中最重要，肯定会有变化，其中甲状腺轴T3或T4或二者均显着降低。黄仕文［9］等通过对寒凝胸痹大鼠研究发现，其模型组(未给药)NO、SOD水平均明显低于空白对照组。苏健［10］等对月经病寒凝血瘀证患者研究发现，患者组血浆NO有降低趋势。实验结果表明，大鼠发热后寒热错杂组的大鼠T3、T4、NO、SOD含量下降，与正常组比较差异有统计学意义。表明机体在发热时可同时表现出虚寒状态，而MDA含量降低，可能是因为动物机体在寒热因素的共同刺激下，生物机能低下、代谢紊乱的结果，具体原因尚待研究。
总之，应用多因素复合造模法制作虚寒证模型，在此基础上皮下注射干酵母致大鼠发热，造成约40 h左右的“寒热并见”动物模型是可行的。该造模方法简单易行、成功率高、数据量化，能模拟寒热错杂证临床表现及病理生理过程，为进一步科学阐释“寒热并用”的配伍机制、探索寒热药性、研究“寒热并用”方剂和治法提供了新的技术平台。
［1］栗德林，朴胜华.寒热错杂证探微［J］.中医药学报，2003，31(6):15-17.
［2］周永学.论方剂配伍中的寒热并用［J］.现代中医药，2002(5):3-4.
［3］陈小野，周永生，樊雅莉，等.大鼠虚寒证模型的研制［J］.中国动物实验学报，2001，9(3):155-159.
［4］卢德赵，沃兴德，李毅，等.温补肾阳药对丙基硫氧嘧啶引起肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响［J］.中华中医药杂志，2007，22.
［5］卢芳，董培良，陈平平，等.3种热病证候模型最佳造模方法的探索与评价［J］.山东中医杂志，2009，28(2):114-116.
［6］若秋，刘渡舟.寒热错杂证之研究［J］.陕西中医，1991，12(1)22-24.
［7］李敏，张冰，刘小青，等.虚寒状态大鼠cAMP变化机制的实验研究［J］.中国中医药信息杂志，2010，17(2):33-344.
［8］薛春苗，张冰，金锐，等.虚寒状态动物模型的评价研究［J］.中华中医药杂志，2012，27(8)2037-2041.
［9］黄仕文，戴启刚.乌头赤石脂丸对寒凝胸痹大鼠血液黏度、TXB2、6-keto-PGF1α、ET、NO、SOD 及 MDA 的影响［J］.山西中医学院学报，2012，13(3):56-58.
［10］苏健，杜慧兰.月经病寒凝血瘀证与ET、NO的关系及加减温经汤对其影响［J］.中成药，2007，29(11):1571-1574.
