巨少华， 代 渊， 王 平， 徐世军△
(1.四川省中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地，成都 611137；2.成都中医药大学，成都 611137)
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为主的全身性自身免疫性疾病，以滑膜增生、慢性侵蚀性炎症和自身免疫进程为特征，常常累及周围关节[1]。其病理表现主要为由免疫反应引起的滑膜炎、增生和肉芽浸润，从而破坏关节的软骨面、软骨下骨质、关节囊、韧带和肌腱组织，逐渐导致关节的强直、畸形和功能严重受损，表现为慢性对称性的关节炎[2]。我国RA患病率为0.32～0.36%左右[3]，世界上约有1%的人受其影响[4]。近年来对于RA发病机制的认知和治疗策略有了显着的改善[5]，最新的生物制剂如TNF-α针等应用治疗RA取得了一定的进展，但还是没有彻底治愈此类疾病。在过去的几年，人们发现RA滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovialbroblasts,RASF)为RA病情的发展和关节破坏的关键因素。相关研究发现，在没有细胞免疫和体液免疫的情况下，RASF依旧可保持其活化表型[6]并破坏软骨，且与正常滑膜成纤维细胞的形态和基因表达模式不同[7]，表观遗传修饰在RA的病程变化中扮演了重要的角色。
表观遗传学(epigenetics)是传统遗传学的分支，最早由英国科学家Waddington于1942年提出[8]。其涵义为DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达与功能发生改变，并产生可遗传的表型，在生物体内从一代传到另一代[9，10]。这种现象首先在植物中被发现[11],现已扩大到酵母、果蝇、小鼠和人类等[12～14]。表观遗传学主要有以下调节机制，即DNA甲基化[15]、组蛋白甲基化及乙酰化[16]及非编码RNA[17]。 本文主要从RASF的表观遗传修饰，特别是不同的表观遗传修饰在RA发展中的作用进行阐述。
1 DNA甲基化与RA
DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化S腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶的反应[18]。DNA甲基化是表观遗传学的一个重要修饰，在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸上，涉及整个基因组70～80%的CpG位点[19]。生物体一生中都发生着DNA甲基化模式的改变，一些变化可能是环境改变的生理反应，另外一些变化可能与恶性转化或细胞老化等病理进程有关。
DNA甲基化模式的可继承性使基因组的表观遗传标记在大量的细胞分裂过程中得以稳定，从而建立了一种细胞记忆的形式。近来研究发现，RA患者存在基因组DNA的广泛低甲基化，尤其是滑膜成纤维细胞(RASF)内的DNA长散布核元件(LINE-1)启动子上富含GC的CpG岛序列，其发生低甲基化作用导致某些基因的异常表达，从而参与RA的全身及关节局部炎症[20]。研究者发现，RA组织中正常沉默逆转录L1因子存在异常表达，用甲基化试剂5-氮-2’-脱氧胞苷培养滑膜成纤维细胞(SF)的诱导治疗，揭示了DNA低甲基化在RA发病过程中起到了功能性作用[21]。基于以上迹象，研究人员对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)和类风湿关节炎组织全部DNA低甲基化进行检测，并在低甲基化环境中培养正常滑膜成纤维细胞得到了与类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)相类似的活化表型[22]。所有DNA低甲基化被证明是由于类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)多胺代谢的增加和S-腺苷-L-甲硫氨酸水平下降所致[23]。另外，除了在RA中DNA甲基化模式有所改变外，单个基因例如趋化因子(CXC基序)、配体12(CXCL-12)的启动子区域也发生甲基化[24]。最近研究表明，单一CpG序列中IL -6[25，26]和IL-10[27，28]基因的启动子去甲基化与基因表达水平有关，因此有助于在疾病过程中细胞因子水平的提高，这也反映了DNA甲基化与RA发病过程中炎症的相关起因。
分子和遗传学研究都表明DNA胞嘧啶甲基化与沉默基因有关，并且在诸如X染色体失活、基因印记等事件中起重要作用。DNA甲基化参与RA发病机制的另一项研究主要是对女性第2个X染色体沉默进行调查，这项研究发现了在RA患者中倾斜性XCI状态升高。而随机XCI，至少有80%的细胞表现出相同的X染色体失活[29]，说明XCI嵌合体参与了RA的发病，并且这也可能是为什么RA在女性中更为普遍的原因。
2 组蛋白修饰与RA
组蛋白包括组蛋白 H1、H2A、H2B、H3和H4，H2A、H2B、H3和 H4组蛋白各2个分子形成1个8聚体, 组蛋白H1起到连接的作用, 把每个核小体连接到一起。组蛋白通过装入核小体核心部分以包装DNA，使DNA双螺旋结构环绕其上。组蛋白在进化中进一步多样化为各种变体，产生了具有表观遗传学效果的染色质分化。组蛋白修饰包括组蛋白的乙酰化与去乙酰化、甲基化与去甲基化、组蛋白的磷酸化及泛素化，这些修饰因素单一或共同作用来调节基因的表达与功能的发挥[30]。在RA中组蛋白主要通过乙酰化、去乙酰化和甲基化参与病情的发展。
组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)相互调节细胞蛋白乙酰化状态。人类的18种HDACs已经被确定并分为4种类型(表1)，其抑制剂常被用于研究RA的发病机制。HATs和HDACs不仅针对组蛋白，而且还针对其他蛋白质如转录因子NF-κB和信号传导转录激活因子3。这些转录因子在炎症过程中扮演着重要的角色，同时参与了RA的发病过程。在对关节炎的研究中发现，与正常个体比较，RA滑膜组织中总组蛋白酶去乙酰化酶活性增加，且总滑膜组蛋白去乙酰化酶活性和HDAC1表达与TNF-α含量密切相关。TNF-α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的刺激导致细胞滑膜组蛋白去乙酰化酶活性和HDAC1表达暂时性的增加。由TNF-α刺激的组蛋白去乙酰化酶活性与表达的时序变化与滑膜成纤维细胞因子信号蛋白相一致，包括核因子-κB-B(NF-κB)p65、JAK / STAT信号混合物、AP -1 和p53，因此在RA滑膜成纤维细胞中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂阻止NF-κB p65的激活[31]，基因调控的表观遗传机制认为这有助于对免疫介导的炎症性疾病复杂病理的认识。Nishida和他同事的研究结果证实，HDAC抑制剂FK228通过诱导P21和P16基因启动子的乙酰化来抑制RASF的增殖[32]。高剂量的TSA和Nicotinamide可以使RA巨噬细胞诱导细胞凋亡[33]。因此，HDAC抑制剂可能对RA滑膜增生产生积极的影响：一方面通过抑制RASF的增殖，另一方面在巨噬细胞中诱导细胞凋亡。炎症部位组蛋白去乙酰化酶活性降低与炎症部位疾病的严重程度、炎症细胞因子产生和糖皮质激素抵抗有一定的相关性，组蛋白去乙酰化酶活性降低可能有助于RA病理认识和在未来使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂对RA患者进行抵抗治疗[34]。
关节炎动物模型已证明HDAC抑制剂在体内的有益效果[32，35～38]。自身抗体介导的关节炎小鼠模型全身HDAC抑制剂FK228给药减少了关节肿胀、滑膜炎症和骨与软骨的破坏[32]。在CIA关节炎大鼠和小鼠中研究了HDAC抑制剂SAHA和MS-275的预防性和治疗性影响，这项研究得出HDAC抑制剂是一种创新的RA治疗策略的结论[35]。在同一模型中，TSA的量效可以减少关节炎的临床体征。笔者观察到组蛋白H4乙酰化细胞、MMP1(TIMP1)的组织抑制因子、阳性细胞分别增加，免疫组化染色检测到MMP3和MMP13的阳性软骨细胞信号降低[36]。此外，HDAC抑制剂丙戊酸(VPA)能显着降低CIA小鼠的发病率和严重性。这些影响通过改善CD25+FOXP3+调控的T细胞的功能来发挥作用，而CD25+FOXP3+调控的T细胞在RA患者中是有缺陷的[37]。
在RA发病机制中，除了乙酰化以外还有其他组蛋白修饰作用外，研究发现了类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)中组蛋白甲基化转移酶(EZH2)的过度表达。EZH2是多梳基因家族抑制复合体2的催化亚基，它给特定沉默基因H3K27添加了三甲基标记物。作为一种MMTV整合位点(Wnt)信号通路抑制剂，它的过度表达导致相关蛋白分泌减少，在RA发展中起着重要作用，并与关节炎症发病机制有一定的牵连[39]。
表1 组蛋白去乙酰化酶的分类及其抑制剂[40]
人类组蛋白去乙酰化酶(HDACs)分为4个小组。SAHA为辛二酰苯胺异羟肟酸，SIRT为sirtuin，TSA为曲古抑菌素A，VPA为丙戊酸。
3 miRNA与RA
miRNA是大小约22个核苷酸(nts)的内源性非编码小RNA，对基因进行转录后调控，参与细胞增殖、分化、代谢和凋亡等过程。它通过结合靶基因的3’非翻译区起到基因表达翻译后的阻遏作用，这导致了翻译过程的降解或抑制。
这些miRNA分子在没有基因编码序列改变的情况下能够改变基因和蛋白的表达, 所以它们在表观遗传修饰中有着重要作用。对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)和骨关节炎滑膜成纤维细胞(OASF)中260个差异表达的miRNA进行筛选，发现类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)中miRNA一列数组存在过度表达，最为突出的是miR-203。RASF中miR -203的过度表达导致MMP1表达增加并提高了IL-6的分泌率[41]。另外，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)中下调和受启动子区域甲基化调节的miRNA是miR-34A*，miR-34A*表达下降导致了其靶点伴X染色体抑制凋亡蛋白的上调，从而有助于类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)抗凋亡表型的产生[42]。
4 总结与展望
通过对RASF中DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA的研究，我们发现表观遗传学与RA的病理机制密切相关。一些研究表明，表观遗传学对类风湿关节炎滑膜成纤细胞内在表型的激活起一定作用[43]，这些同时也可以作为动物模型中探究RA表观遗传学机制的数据点。现在仍旧需要更多数据来阐明何种修饰引起RA的发生，何种遗传变化产生于慢性疾病中。虽然在RA中DNA甲基化的不同模式图变得越来越清晰，但仍有一些表观遗传修饰尚未研究，或者已发现的修饰在RA发病机制中发挥何种作用。表观遗传学和miRNA介导的改变与疾病的研究正变得越来越重要，这些进程直接参与基因的异常表达，并最终确定细胞功能和药理学的可逆性。
遗传和环境因素在风湿免疫疾病中扮演着重要角色，而这两者也在同卵双胞胎的部分一致性中得到体现。此外，环境在确定自身免疫性疾病中起着关键作用。许多环境因素，包括暴露于化学品、烟草烟雾、辐射、紫外线(UV)光、传染性病原体等其他外部因素，都与风湿免疫疾病的发展有关。目前研究表明，这些环境因素直接或间接诱发表观遗传与细胞功能的变化，调节基因的表达。因此，表观遗传学提供了一个源自分子的机制来解释环境对自身免疫性疾病发展上的影响[44]。环境、表观遗传状态和自身免疫性风湿性疾病之间的密切关系也常利用动物模型来例证，这种类型的研究为疾病的产生、发展和治疗成效提供了新的临床鉴定指标。
总之，表观遗传学的认识和研究已经使人类在基因方面迈上了一个新的台阶。表观遗传学将作为新的武器，对一些重大的和难以攻克的医学、遗传学难题做出解答。RA的表观遗传学研究任重而道远，希望在未来对RA表观遗传调节机制的详尽掌握有助于开发出新的药物，能够预防或者彻底根治RA。
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