李光超，车念聪,耿建国，赵 晖，王志强，郭新新，白 辰
(1．首都医科大学中医药学院,北京 100069； 2．北京市平谷区中医医院,北京 101200)
“肝肾同源”是中医的经典理论之一，是指肝肾的结构和功能虽有差异但其起源相同,生理病理密切相关,可采用“肾肝同治”的治疗法则[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropahy, DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其主要的病理变化是肾小球硬化和肾间质纤维化[2]。研究显示，TGF-β/Smad通路的激活是该病发生发展的重要环节，激活的TGF-β/Smad通路可以增加细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)中各种成分的表达，加速ECM进行性积聚，从而导致肾小球硬化[3]。α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, a-SMA)被认为是肌成纤维细胞(myofibroblast,MyoF)的标志蛋白，肌成纤维细胞具有活跃的增殖和分泌胶原的能力，是细胞外基质的主要来源，而细胞外基质沉积增多是DN的主要病理特征[4]。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一种潜在的促有丝分裂的细胞因子，主要分布于增生的毛细血管内皮细胞、成纤维细胞和增生的肾小球细胞中。PDGF的过度表达可以促进系膜细胞增生和细胞外基质沉积，进而引起肾纤维化[5]。与此同时，在发生肝损伤时，上述指标也可以发生相应改变。基于此，本实验在中医“肝肾同源”理论的指导下，通过观察中药方剂加味消渴康对糖尿病肾病大鼠肝组织TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF治疗前后表达的影响，探讨其对DN大鼠肝脏的保护作用，从而为临床糖尿病肾病“肝肾同治”提供实验依据。
1 材料
SD雄性大鼠60只，体质量 160～180 g，鼠龄2～3月，购自首都医科大学实验动物科学部(动物合格证号SCXK(京) 2006-0009)；加味消渴康[6](为首都医科大学耿建国教授治疗糖尿病肾病的经验方，由生黄芪、山萸肉、生薏苡仁、水蛭、葛根、丹参、决明子组成)购自北京祥威药业公司；氯沙坦购自杭州默沙东制药有限公司(生产批号100438)。链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)美国Sigma公司；大鼠TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF ELISA试剂盒上海蓝基生物科技有限公司；全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)；电热恒温培养箱(DH4000A，天津泰斯特)。
2 方法
2.1 动物模型制备及分组
本实验采用单侧肾切除加腹腔注射链脲佐菌素的方法制作DN大鼠模型：将造模大鼠适应性饲养1周后，行右侧肾脏切除术。术后2周，禁食12 h，按50 mg / kg剂量进行单次腹腔内注射链脲佐菌素。72 h后尾静脉采血，用sure-step血糖仪测定大鼠血糖，用尿糖试纸测大鼠随意尿糖，血糖浓度≥16.7 mmol/L，尿糖定性>+++，确定DN造模成功[7]。将造模成功的大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、氯沙坦组(5.2 mg/kg·d-1)、加味消渴康小剂量组(13.125 g/kg·d-1)、加味消渴康中剂量组(26. 25 g/kg·d-1)、加味消渴康大剂量组(52. 5 g/kg·d-1)，另取10只大鼠作为正常对照组，每日1次，连续灌胃12周，正常组和模型组每日灌服2 ml蒸馏水。
2.2 标本采集和观察指标检测
各组大鼠于第12周末进行肝脏取材，每只取肝组织150～200 mg，以肝组织质量：生理盐水量比例为1∶7。在冰浴中制备匀浆后4 ℃ 3000 r/min离心20 min，取上清液0.1 ml放入4 ℃冰箱备用。取出大鼠TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF Elisa试剂盒，室温25～30 ℃放置30 min。取出酶标板，按照标准品次序分别加入50 μL的标准品溶液于空白微孔中。空白微孔中加入50 μL的样品，空白对照加入50 μL的蒸馏水。在各孔中加入100 μL的酶标记物溶液(不含空白对照孔)。将酶标板用封口胶密封后，37 ℃孵育反应1 h(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)。充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压(浓缩洗涤液以1∶100的比例与蒸馏水稀释)。酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。各孔加入显色剂A、B各50 μL后，37 ℃避光反应10～15 min。各孔加入50 μL终止液终止反应。
2.3 统计学方法
3 结果
表1显示，与正常组比较，模型组大鼠肝中TGF-β1、 Smad-4、a-SMA、PDGF含量均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组大鼠的TGF-β1、 Smad-4、a-SMA、PDGF含量均有不同程度降低(P<0.01或P<0.05)；其中中药大、中剂量组与中药小剂量组比较，Smad-4含量明显降低(P<0.01或P<0.05)。
表1 各组大鼠肝组织TGF-β1，Smad-4、a-SMA和PDGF比较
注：与正常组比较：*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较：▲P<0.05,▲▲P<0.01;与中药小剂量组比较：#P<0.05,##P<0.01
4 讨论
研究显示，糖尿病肾病大鼠可以存在早期肝纤维化[8]。究其原因，西医认为可能与持续的高血糖导致糖原在肝脏蓄积、发生微血管病变以及人体内分泌紊乱等进而波及肝脏有关。中医认为，肝肾在生理上关系密切，病理上相互影响，即“肝肾同源”。故当肾脏发生损害时,肝脏的生理功能也会受到影响，发生肝损伤。
中医认为，肝属木，主疏泄、藏血，主筋华爪，开窍于目，具有升发、喜条达、恶抑郁、体阴而用阳的特性。肾属水，主藏精、纳气，主生长发育和生殖，主骨生髓，开窍于耳，为人体的先天之本。在生理上，肝肾为子母关系，其气相通，肝木得到肾水的滋养才能得以维持正常的生理功能。同时，肾藏精、肝藏血、 “精血同源”，肝中之血与肾中之精可以相互化生、相互充养。本实验的研究对象为DN大鼠，而糖尿病肾病的中医基本病机为本虚标实、虚实夹杂，本虚以脾肾亏虚为主，标实则指痰浊、水湿、瘀血、毒邪等。由于该病发展是一个慢性过程，故病久必侵袭肾络，导致肾络瘀滞，即“久病入络”。而中医认为肝肾之气互通、精血互化，故肾脏的损伤必然会导致肝的藏血和疏泄等功能受损，最终致使肝之血行不畅而发生肝络瘀阻。
从实验结果可以看出，模型大鼠肝组织TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF的表达与正常组比较均有一定程度的升高。研究发现，TGFβ1/Smad通路的激活可以促进肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)合成胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外基质,促进金属蛋白酶组织抑制物的分泌,下调降解蛋白酶的合成而减少ECM的降解,进而使ECM沉积增多[9]。而a-SMA为HSC的细胞骨架表型，若肝脏中出现a-SMA阳性细胞，则提示HSC向肌成纤维细胞转化，故α-SMA可作为HSC激活的一个标志[10]。PDGF则是一种强有力的促有丝分裂原，它不仅可以促进HSC的活化、分裂、增殖、迁移，且与TGF-β具有协同促纤维化作用[11]。由此看来，上述指标都与HSC的激活有着直接或间接的联系。而激活的HSC可以通过增加ECM生成并降低ECM的降解，最终致使细胞外基质增多。同时，ECM在肝脏的过度聚集势必会影响肝脏正常的血行，导致其血流不畅，而这也恰与中医的“瘀血”病机甚为相似。因此，笔者推断该过程可能是导致肝络瘀阻的发生机制之一。在用中药进行干预后，DN大鼠肝中TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF的表达均有不同程度的降低趋势，说明该方对DN大鼠肝损伤具有正向的调节作用。即在治疗肾脏的同时，大鼠肝损伤也得到了一定的修复，此结果也与中医的“肝肾同源”理论相符，并为其提供了一定的实验依据。由此可知，在糖尿病肾病大鼠中，肝肾既可“同病”亦可“同治”，其既有理论推断又有实验依据。
本研究显示，在糖尿病肾病发生时，肝脏中TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF也发生了不同程度的改变，说明糖尿病肾病大鼠存在肝损伤。这就提示在临床上在治疗糖尿病肾病的同时，也需要保护肝脏，而对于肝损伤病理形态学的观察及其他指标的检测则有待进一步的研究。
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