王彩霞
(宁夏医科大学高等卫生职业技术学院，宁夏 银川 750004)
人体衰老是一个全方位、多因素、系统的退行性生物学过程，是无法抗拒的自然规律，但可以缓解[1]。针灸具有疏通经络、调畅气血、扶正祛邪、协调阴阳的功效，自古以来就被列为抗老防衰、延年益寿的重要措施[2]。本研究拟采用D-半乳糖颈背部注射小鼠建立亚急性衰老模型，观察针灸 “足三里”、“关元”穴对衰老模型小鼠皮肤组织中LF含量、T-AOC活性及HYP含量的影响，从而探究针灸对亚急性衰老模型小鼠皮肤的抗衰老作用，为针灸在临床延缓衰老的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级昆明种雌性小鼠40只，3月龄，体质量(30±2)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。
1.2 药品与试剂
D-半乳糖为上海试剂二厂产品(批号20121108)，总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(批号20121203)、脂褐质(LF)试剂盒(批号20121019)均购于南京建成生物工程研究所。
1.3 实验仪器
722分光光度计(上海第三分析仪器厂)、FL45荧光分光光度计(美国PE公司)、TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂)、DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机(上海将来实验设备有限公司)、BLG10电子秤(上海精科天美科学仪器有限公司)、DK-420S型三用恒温水箱(上海精宏实验设备有限公司)、ELx808全自动酶标仪(美国佰腾)。
1.4 分组与造模
将40只小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、针刺组、艾灸组各10只。采用D-半乳糖致亚急性衰老法[3]，除空白组外其余各组小鼠给予颈背部皮下注射12.5%D-gal(1000 mg·kg-1·d-1)进行造模，空白组小鼠颈背部皮下注射与模型组等容量的生理盐水。以上操作每日1次，连续42 d,注射均按无菌操作要求进行。
1.5 治疗方法
从注射的第22天开始治疗,时间选择上午9∶00～12∶00，取小鼠“关元”穴及双侧“足三里”穴，定位取穴按余曙光主编的《实验针灸学》[4]。治疗方法：将小鼠清醒固定，针刺组以消毒的30号1寸“华佗牌”不锈钢毫针常规直刺“足三里”、“关元”穴，每穴行均匀捻转刺激30 s，以小鼠不挣扎嘶吼为度，留针5 min，每天1次。艾灸组穴位选定后剪毛，施灸时涂以凡士林，目的是保护小鼠皮肤且便于固定艾炷，用自制艾炷(直径约5 mm)施灸，当小鼠挣扎时(以局部红晕或潮红为度)更换艾炷，每穴灸5 min，每天1次。空白组、模型组只给予相同固定，以上操作连续21 d。于最后1次治疗24 h后断颈处死小鼠，取背部两肩胛部之间皮肤(去毛)，面积为2 cm×3 cm冰冻保存，拟作皮肤匀浆。
1.6 10%皮肤组织匀浆的制备及指标测定
取脱毛后背部皮肤组织约0.5 g，在冰生理盐水中漂洗，除去皮下脂肪及其他结缔组织，滤纸拭干后称重，量筒量取该组织块9倍重量的冰生理盐水，先取23量倒入装有组织块的烧杯中，小剪剪碎组织块倒入匀浆管中，剩余13生理盐水冲洗烧杯壁，组织匀浆机制成10%组织匀浆。浆液以3500 r/min的速度离心20 min，取上清液并按照试剂盒说明测定皮肤组织LF含量、T-AOC活性及HYP含量。
1.7 统计学方法
2 结果
表1显示，与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织LF含量升高(P<0.01)，T-AOC活性降低(P<0.01)，HYP含量降低(P<0.01)。与模型组比较，针刺组、艾灸组小鼠皮肤LF含量明显降低(P<0.05,P<0.01)，T-AOC活性与HYP含量均显着升高(P<0.01)，表明针灸均能明显降低衰老模型小鼠皮肤组织中LF含量，提高T-AOC及HYP含量。
表1 针灸“足三里”穴对小鼠皮肤组织T-AOC活性及LF、HYP含量的影响
注：与空白组比较：▲▲P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型是研究抗衰老药物的经典模型。D-半乳糖在醛糖还原酶的作用下生成半乳糖醇，而后者不能被细胞进一步代谢，致使细胞代谢发生紊乱，消耗并破坏机体抗氧化物质，并不断产生自由基，进而导致组织细胞受损和功能障碍，从而造成实验性亚急性衰老模型[5]。因其衰老变化明显、模型稳定，故在抗衰老研究中被广泛应用[6]。
大量研究表明，衰老与氧自由基增多造成的氧化损伤有关。健康生物体内有抗氧化的酶系统(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT及谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX等)和非酶系统(β胡萝卜素、维生素E、谷胱甘肽、白蛋白、尿酸等)，可及时处理氧自由基，体内抗氧化力的降低将加剧氧自由基损伤，因此抗氧化力的检测引起人们的普遍关注。T-AOC可反映皮肤中酶与非酶全部的抗氧化物，是一个全面反映皮肤组织抗氧化力的良好指标。LF是组织细胞遭受自由基严重损伤后出现的异常痕迹，是机体衰老的表现。机体在新陈代谢过程中，不断产生自由基，自由基形成后又不断攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，形成过氧化脂质，后者与膜脂和膜蛋白聚合，交联形成LF沉积于组织中，造成细胞功能障碍，促进细胞衰老[7]。因此，LF含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。随着年龄的增长，皮肤胶原产物逐渐减少，故检测胶原蛋白的变化可反映皮肤衰老的状况。Hyp 是胶原纤维与胶原蛋白中的一种主要且相对恒定的非必需氨基酸，它可修复受损皮肤组织，增加皮肤弹性，使皮肤光滑、靓丽[8]，其含量已成为检测机体胶原代谢的重要指标，也是判定皮肤衰老的指标之一[9]。
“足三里”为足阳明胃经的合穴，是历代医家公认的防病抗衰的强壮要穴，属后天之本，针灸该穴有健脾益胃、培土化元之功[10]。“关元穴”位于任脉上，属先天之本，是任脉与足三阴经的交会穴，针灸该穴可调节全身诸阴经之经气，有“保健穴”和“长寿穴”之称[11]。人体是一个有机的整体，机体衰老可表现于外而引起皮肤衰老。选用两穴能起到调节阴阳平衡的作用，使先天之本与后天之本有机结合，达到抗皮肤衰老的效果。
本实验结果显示，模型组小鼠皮肤细胞代谢紊乱，皮肤LF含量显着升高，T-AOC活性明显降低， HYP含量显着降低。针灸“足三里”、“关元”穴可显着降低D-半乳糖衰老模型小鼠皮肤组织LF含量，明显提高小鼠皮肤组织T-AOC活性，升高HYP含量，提示针灸能有效地延缓小鼠皮肤衰老。其机制可能是通过激发机体对外源性微量元素的摄入，加强机体对内源性抗氧化物质的合理利用，并从一定程度上调动人体的潜能，提高抗氧化能力，使之有效地清除自由基，减轻或抑制脂质过氧化损伤，从而起到延缓衰老的作用。
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