孙 萌，刘 颖，王克林，孙 刚，王笑红，翟志光，孙佩珠，王 健△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 2.中国中医科学院艾滋病防治研究中心，北京 100700)

人类γ δ-T淋巴细胞在外周血中的比例较小，大约占人外周血T淋巴细胞总量的3%左右，且主要表达Vγ2Vδ2 T淋巴细胞受体，75%的该受体基因发生过Vγ2-Jγ1/2链(TCR-)基因重排[1]。γ δ-T淋巴细胞主要分布在机体黏膜局部, 因而被视为机体受到抗原刺激后首先发生应答的一线防御细胞。由于γ δ-T与α β-T 淋巴细胞比较，具有在感染后能够更迅速增殖、能调节CD4+和CD8+T淋巴细胞功能、不需要抗原提呈直接识别抗原等能力，因此γδ-T细胞在机体黏膜免疫抗病毒和抗肿瘤方面发挥着不可忽视的作用[2]。

理论上讲，机体未受任何抗原刺激，其γ δ-T细胞受体(TCR-链)基因的重排是随机的，表现为多家族和多克隆性，而当其受到肿瘤病毒抗原等相应抗原刺激后，γ δ-T细胞受体(TCR-链)基因谱系会呈现寡克隆优势并出现克隆性改变。目前对HIV感染者γ δ-T细胞受体(TCR-链)多态性较完整的研究尚少见报道。本研究运用多重引物PCR片段荧光分析技术，对HIV/AIDS患者的γ δ-T细胞受体(TCR-链)进行了基因重排分子测定，为中医药治疗免疫系统紊乱和缺陷疾病的疗效评价提供一种新的方法手段。

1 资料与方法

1.1 临床资料

健康人群来自中国中医科学院研究生院学生，阳性被试人群来自北京市地坛医院跟踪随访的HIV/AIDS患者，全部由地坛医院蛋白印记试验确认为HIV抗体阳性。HIV/AIDS患者分类按照美国疾病预防控制中心修订的HIV感染分类与CD4+T 淋巴细胞计数分期方法，每毫升血液CD4+T淋巴细胞数小于200为AIDS患者。筛选后确定3组被试人群，其中包括10名健康人，20名HIV感染者以及10名AIDS患者。

1.2 全血DNA提取

清晨采静脉血外周血2 ml, 将真空采血管内血样混匀，取300 ul抗凝全血，采用Promega 公司的Maxwell 16 Blood DNA Purificanfion Kit自动提取全血DNA系统。检测蛋白含量符合荧光PCR要求，OD 260/280值在1.8～2.0之间。

1.3 γ δ-T细胞受体TCR-基因荧光PCR 反应

1.3.1 PCR引物 图1显示，引物由上海生工生物工程公司合成，TCR-基因重排的检测需要进行2管PCR扩增试验，其中TCR-链基因重排的检测PCR引物设计。

图1 TCR-链PCR引物设计示意图

图2 健康人群组γδ-T细胞受体(TCR-链)基因谱型扫描分析图(包括A、B两管PCR产物分析图)注：X轴为荧光PCR 产物片断大小，Y轴不同高度的峰相对应荧光PCR产物的荧光强度

TCR-γ: A管: 正向引物：Vγf1(-178) 5′-GGAAGGCCCCACAGCRTCTT-3′； Vγ10(-126) 5′-AGCATGGGTAAGACAAGCAA-3′。 反向引物：Jγ1.1/2.1：3′-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5′-HEX * (+64)；Jγ1.3/2.3 3′-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5′-HEX * (+38)。

TCR-γ：B管: 正向引物：Vγ9(-141) 5′-CGGCACTGTCAGAAAGGAATC-3′；Vγ11(-58) 5′-CTTCCACTTCCACTTTGAAA-3′。反向引物：Jγ1.1/2.1：3′-CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT-5′-HEX* (+64)；Jγ1.3/2.3 3′-GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG-5′-HEX * (+38)。

1.3.2 PCR反应体系和条件 采用Promega的T-Easy PCR 试剂盒，其中 TCR-链基因重排总反应体系均为20 ul，分别加入工作反应物，确保20 ul 的PCR反应体系。PCR反应条件为96℃变性 10 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 个循环，最后72℃再延伸10 min。

1.3.3 上机检测 采用ABI-3100 基因片断分析仪进行荧光多重PCR产物的片段分析。荧光PCR产物经ABI-3100 基因片断分析仪分析，并通过GeneMarker V1.95软件扫描分析。

1.4 统计学方法

运用TCR Assay1.0 定量分析软件计算正常人个体TCR-受体链基因PCR产物分别多样性D值(产物标准差与均值之百分比)，D值可以定量表示TCR多样性变化以及离散情况。计算健康人群和与HIV/AIDS 患者γ δ-T细胞受体(TCR-链)基因分布的均值、标准差以及与均值比率表示离散距离D(Distance)值。应用Microsoft Excel 2003 (Microsoft) 进行统计分析和作图；健康人群与HIV/AIDS患者组间离散距离D(Distance)值比较用独立样本t检验。以CD4+T 淋巴细胞数是否小于每毫升全血350个为分组标准，将HIV/AIDS患者分为2组进行比较，CD4+T细胞数与T淋巴细胞TCR-受体基因多样性变化的相关分析为Pearson 积差相关，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康人群与HIV/AIDS患者γ δ-T细胞受体(TCR-链)基因荧光PCR产物扫描分析

图3 HIV感染者γδ-T细胞受体(TCR-链)基因谱型扫描分析图(包括A、B两管PCR产物分析图)注：X轴为荧光PCR 产物片断大小，Y轴不同高度的峰相对应荧光PCR产物的荧光强度

图4 AIDS患者γδ-T细胞TCR-链受体基因谱型扫描分析图(包括A、B两管PCR产物分析图)注：X轴为荧光PCR 产物片断大小，Y轴不同高度的峰相对应荧光PCR产物的荧光强度

2.2 健康人群与HIV感染者γδ-T细胞受体(TCR-链)基因重排多样性比较

表1显示，健康人群与HIV感染者比较结果显示，HIV感染者与AIDS患者的平均D值显着高于健康人群(P<0.05)，说明健康人群 TCR-受体链基因PCR产物离散性较小，更接近正态分布特征；而HIV感染者与AIDS患者之间，TCR-受体链基因PCR产物离散度比较差异无统计学意义，说明HIV感染者和AIDS患者组TCR-受体链基因PCR产物多样性变化比较大，离散性也比较大。同时以CD4+T 淋巴细胞数是否小于每毫升全血350个为分组标准，将HIV/AIDS患者分为2组进行比较，尽管2组感染者之间的CD4+T淋巴细胞数有显着差异，但2组T淋巴细胞TCR-受体链基因PCR产物离散度差异无统计学意义，且HIV/AIDS患者CD4+T 淋巴细胞数与TCR-受体链基因PCR产物离散度呈负相关，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 健康人群与HIV/AIDS患者γ δ-T细胞受体

(TCR-链)基因片断多样性比较

表1 健康人群与HIV/AIDS患者γ δ-T细胞受体

A管PCR产物离散度D值(%)B管PCR产物离散度D值(%)健康人群10.5±3.63.8±1.5HIV感染者18.6±4.8*6.6±3.9*AIDS患者21.6±5.3*10.2±3.3*

注：与健康人群比较：*P<0.05

3 讨论

近年来，γ δ-T细胞在HIV病毒早期感染中的损伤逐渐得到关注，有数据支持γ δ-T细胞可以作为HIV病毒感染及疾病发展进程的标志免疫细胞[3]。尽管γ δ-T细胞没有CD4受体，HIV病毒并不直接感染损害γ δ-T细胞，但γ δ-T细胞可以作为HIV病毒感染及疾病发展进程的标志免疫细胞，γ δ-T细胞对调节HIV感染者黏膜免疫感染至关重要。国外研究显示，为期2年的高效抗病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART) 能够降低HIV感染者体内的病毒载量以及提升CD4+T细胞数，但并不能有效地恢复γ δ-T细胞的功能和数量[4]。未经HAART治疗的长期不进展者(natural viral suppressors，NVSs)体内γ δ-T细胞的数量和功能却能保持正常的水平[5]。从这个角度来看，直接作用调节人体消化道黏膜系统的中草药，是否对HIV感染者体内γ δ-T细胞的功能恢复有所帮助值得研究。

正常人在没有外来抗原特异性刺激的情况下，机体γ δ-T细胞受体(TCR-链)基因片断处于随机重排状态，形成了γ δ-T细胞受体多克隆性，其TCR-链基因片断扫描图类似“钟型”的高斯分布。健康人群γ δ-T细胞受体完整的多样性可以保障机体具有识别外界多样性抗原的潜能。若机体免疫系统处于激活状况，如外界病毒性感染激活和淋巴细胞瘤患者免疫系统呈现动员激活状态，T淋巴细胞受体TCR基因会出现单一化重组表达，其表面标志物受体基因的多样性出现损害，进而导致其他病原体机会感染的增加[6]。目前针对HIV病毒感染导致γδ-T细胞受体基因多样性的研究较少。本研究显示，HIV/AIDS患者体内γ δ-T细胞受体TCR-链基因呈现单一化重组表达，其表面标志物受体基因的多样性出现损害。

本研究还比较了不同水平CD4+T 淋巴细胞数HIV/AIDS患者γδ-T细胞受体基因多样性情况，发现HIV/AIDS患者CD4+T 淋巴细胞数与其γ δ-T细胞受体基因多样性之间有一定的相关性。但相关性不显着，因为本研究只是在一个时间点横断面采集被试人群的资料和数据，还需要进行长期的纵向跟踪研究才能得到更加全面的信息数据。

目前HIV/AIDS患者免疫系统重建的研究工作逐渐引起重视，但临床上评价中医药治疗HIV/AIDS患者疗效及其免疫系统功能的指标仍主要依据CD4+T 淋巴细胞计数和病毒载量，存在很大的局限性，也是亟待研究解决的问题之一。因为CD4+T淋巴细胞计数仅代表CD4+T淋巴细胞的数量，不能完全反映整体免疫系统的功能，特别是早期HIV感染者黏膜免疫系统的功能。最近的研究表明，黏膜免疫系统在HIV感染以及AIDS病理发展过程中扮演了重要角色，大多数HIV感染是通过黏膜传染的，并且在HIV/AIDS整个感染发病过程中，感染者的黏膜免疫系统都存在损伤缺陷[7]。广泛的研究表明，HIV病毒对消化道黏膜免疫系统的破坏、炎性细胞因子以及长期的高效抗逆转录病毒治疗，HAART药物都会使HIV感染者黏膜免疫系统处于激活状态[8-9]。

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[2] Galimberti S,Benedetti E，Morabito F，et al．Differentγδ T clones sustain GVM and GVH effects in muhiplemyeloma patients after non-myeloablative transplantation[J]．Leukerrda Research，2006，30(5)：529-535．

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[4] Andrew M. Hebbeler AM, Propp N, Cairo C, et al. Failure to Restore the Vγ2-Jγ1.2 Repertoire in HIV-infected Men Receiving Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART)[J]．Clin Immunol，2008，128(3)：349-357.

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[8] 钟海兵，陈春晓. HIV感染消化道的发病机制[J]．国际流行病学传染病学杂志，2006，33(6)：385-388.

[9] Brenchley JM, Price DA，Schacker TW, et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection[J]．Nat Med，2006，12：1365-1371.