益气养阴通络法对兔血管内膜剥脱术后VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表达的影响*

杨 莺，李文杰

(辽宁中医药大学附属医院心内科，沈阳 110032)

益气养阴通络法对兔血管内膜剥脱术后VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表达的影响*

杨 莺，李文杰△

(辽宁中医药大学附属医院心内科，沈阳 110032)

目的:观察具有益气养阴通络功效的中药欣舒注射液对兔血管内膜剥脱术后VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表达的影响，探讨欣舒注射液防治PCI术后再狭窄的机制。方法:将48只新西兰大耳白兔按随机数字表法分为A正常组、B模型组、C欣舒注射液组、D阿托伐他汀组每组各12只。2周后采集兔腹主动脉标本光镜观察腹主动脉，RT-PCR法检测腹主动脉VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表达。结论:欣舒注射液可通过增加VEGFmRNA表达，降低bFGF、TGF-β1mRNA表达，起到防治PCI术后再狭窄的作用。

益气养阴通络;血管内膜剥脱术;VEGF;bFGF;TGFβ1;mRNA

经皮腔内冠状动脉介入术(PCI)已成为治疗冠心病的主要手段之一，但术后再狭窄严重影响其远期的治疗效果。经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)术后再狭窄率可高达40%～50%，金属裸支架植入术后约15%～30%，尽管药物洗脱支架(DES)的问世使再狭窄率降低到10%以内，但远期DES的安全问题如迟发性血栓事件、支架贴壁不良等问题值得担忧，故再狭窄已成为影响冠心病介入术后远期疗效的主要障碍。

中医认为，冠脉介入治疗注重局部干预，整体关注不足是其缺点，而整体治疗、整体调节是中医药的优势之一。PCI术后用中药调整阴阳、调畅气血，使阴平阳秘、气血调和，恰好可弥补介入治疗的不足。实验研究也表明，某些中药单体或复方制剂可作用于再狭窄的多个病理环节，临床观察亦证明有较好的疗效，因此中医药在预防和治疗冠脉介入术后再狭窄有良好的应用前景。本研究通过观察具有益气养阴、活血通络功效的中药制剂欣舒注射液对兔腹主动脉球囊损伤术后内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β1 (TGFβ1)mRNA表达的影响，探讨中药欣舒注射液防治冠脉介入术后再狭窄的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰大耳白兔48只，体质量(2.5±0.5)kg，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验药物

1.2.1 欣舒注射液 由人参、麦冬、川芎组成，每1ml含总皂甙以人参皂甙Re(C48H82O18)计，不得少于0.80 mg。

1.2.2 阿托伐他汀 北京嘉林药业股份有限公司(批准文号国药准字H19990258)。

1.3 动物分组

按随机数字表法分为A正常组、B模型组、C欣舒注射液组(简称中药组)、D阿托伐他汀组(简称西药组)。4组各12只，B、C、D组行手术造模。

1.4 动物造模

用20%乌拉坦溶液以5 mL/kg腹腔麻醉家兔，于右侧腹股沟部进行脱毛消毒。切开皮肤分离右股动脉，穿刺右股动脉，逆行导入直径2.5或3.0 mm的球囊导管(依血管直径而定)至肾动脉下方，盐水充盈球囊(压力为4～6 kPa)，缓慢回拉导管至切口处，抽空球囊内液体，使压力降至零。重复上述过程反复3次，达到剥脱动脉内皮的目的，然后撤出导管，结扎股动脉，缝合皮肤。

1.5 动物给药方法

正常组未经手术及用药;模型组术前、术后未用药;中药组于术前1 d开始给予欣舒注射液(4 mL/ kg/d)，耳缘静脉缓慢注射，连续用药15 d;西药组于术前1 d开始给予阿托伐他汀片(1 mg/kg/d)口服，连续用药15 d。

1.6 标本采取

造模2周，实验动物麻醉后小心并迅速分离出腹主动脉，每只截取长约10 mm腹主动脉2段。一段用于光镜检测，生理盐水冲洗后用4%甲醛液固定24 h，4℃冰箱保存;一段用于RT-PCR检测，生理盐水冲洗后立即置液氮内冻存。

1.7 检测指标

光镜观察兔腹主动脉结构，RT-PC R法检测兔腹主动脉VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表达。

1.8 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，先进行组间方差齐性检验，在方差齐的基础上作方差分析，组间两两比较。

2 结果

2.1 光镜结果

引物序列

图1 光镜正常组(4×10)

图2 光镜模型组(4×10)

图3 光镜中药组(4×10)

图4 光镜西药组(4×10)

正常腹主动脉血管壁分为内膜、中膜和外膜，三者界限清楚。模型组可见内膜不规则增厚，使管腔明显狭窄。中药组和西药组也可见到内膜增厚、管腔狭窄，但增生程度较模型组有不同程度的减轻，纤维排列与模型组比较相对整齐。

2.2 RT-PCR结果及分析

欣舒注射液对腹主动脉VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表达的影响(RT-PCR)(±s)

欣舒注射液对腹主动脉VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA表达的影响(RT-PCR)(±s)

注:与模型组比较:▲▲P＜0.01;与正常组比较:＊＊P＜0.01

组 别 例数 VEGF bFGF TGFβ1正常组 10 0.256±0.0234 0.343±0.0397 0.310±0.0281模型组 10 0.288±0.0459 0.686±0.0634＊＊ 0.607±0.0498＊＊中药组 10 0.423±0.0592▲▲＊＊0.535±0.0480▲▲ 0.441±0.0339▲▲西药组 10 0.388±0.0397▲▲＊＊0.519±0.0336▲▲ 0.381±0.0198▲▲

3 讨论

兔腹主动脉球囊损伤后，腹主动脉VEGFmRNA表达虽较正常组高，但与正常组比较差异无统计学意义 (P ＞0.05)，腹 主 动 脉 bFGFmRNA、TGFβ1mRNA表达明显升高，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。中药组、西药组可明显增加VEGFmRNA表达，与正常组、模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，中药组、西药组可明显减少bFGFmRNA、TGFβ1mRNA表达与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 VEGFmRNA琼脂糖凝胶电泳条带图

图2 bFGFmRNA琼脂糖凝胶电泳条带图

图3 TGFβ1mRNA琼脂糖凝胶电泳条带图

图4 β-actin琼脂糖凝胶电泳条带图

欣舒注射液是在益气养阴、活血通络治疗原则指导下组成的中药复方制剂，由人参、麦冬、川芎组成。方中人参大补元气、补脾益肺、生津安神。《医学衷中参西录》曰:“方书谓人参不但补气，若以补血药辅之，亦善补血。愚则谓若辅以凉润之药，即能气血双补，盖平其热性不使耗阴，气盛自能生血也。”麦冬具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦的功效。《本草正义》曰:“麦冬，其味大甘，膏脂浓郁，故专补胃阴，滋津液，本是甘药补益之上品。”川芎具有活血行气、祛风止痛的功效。《本草汇言》:“味辛性阳，气善走窜而无阴凝黏滞之态，虽入血分，又能去一切风，调一切气。”人参、麦冬、川芎合用，共奏益气养阴﹑活血通络之功，且补中有散、补而不滞，行血而不破血，为益气养阴、活血通络之基础方。现代药理研究表明，人参主要成分为人参皂甙，皂甙为人参生理活性的物质基础。人参、黄芪及其水提物可以通过增加血管平滑肌细胞(VSMC)中的一氧化氮(NO)含量而防治动脉粥样硬化(AS)的发生发展［1］。兔结扎冠状动脉前降支，造成实验性心肌梗死后，静注麦冬注射液5 g(生药)/kg，连续5 d，有缩小梗死范围及坏死区域的作用［2］。川芎嗪［3］能有效抑制血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的VSMC增殖，并使G0/G1期细胞数明显增多，而S +G2/M期细胞数明显减少，说明增殖周期停滞于G0/G1期。

本实验中，兔腹主动脉球囊损伤后，血管内膜增生明显，腹主动脉VEGFmRNA表达无明显变化，腹主动脉bFGF、TGFβ1mRNA表达明显升高，提示球囊损伤造成血管内皮不同程度地剥脱、损伤和功能紊乱，势必在术后再狭窄的形成过程中起重要作用。内皮损伤是再狭窄发生的启动及促进因素，内膜完整性的缺失是新生内膜增厚的基础。生理状态下，各种收缩(促)生长因子与扩张(抑)生长因子处于平衡状态，从而调节血管的张力和平滑肌细胞(SMC)生长。当内皮细胞受损、功能失调时，各种收缩(促)生长因子与扩张(抑)生长因子的生理平衡状态被打破，舒血管物质如NO等释放减少，内皮素(ET)等缩血管物质生成增多，bFGF、TGFβ1等生长因子生成增多，导致白细胞、血小板黏附、血栓形成和SMC异常增生，是启动和促进再狭窄的重要原因。VEGF是一种特异的内皮细胞(EC)促分裂剂，它可以促进内皮新生和血管生长。此外，VEGF还有促进纤溶酶活性、防止血栓形成、增加毛细血管通透性和舒张血管的作用，因此VEGF在血管损伤修复和防止再狭窄中具有十分重要的意义。本实验中，中药组和西药组可抑制内膜增生，治疗后内膜增生程度有不同程度的减轻，腹主动脉VEGFmRNA表达升高，腹主动脉bFGFmRNA、TGFβ1mRNA表达下降，说明中药欣舒注射液可促进球囊损伤血管的内皮修复，防止再狭窄的发展。

中药欣舒注射液可通过增加VEGFmRNA表达，降低bFGF、TGF-β1mRNA表达，促进球囊损伤血管的内皮修复，起到防治PCI术后再狭窄的作用。

［1］靳朝东.通过黄芪、人参和黄芩提取物的处理增加血管平滑肌中NO含量和环磷鸟苷含量［J］.中草药，1996，27:316.

［2］赵国平，戴慎，陈仁寿.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，2013:1429.

［3］张健，蔡生业，姚成芳，等.川芎嗪对PDGF-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和骨桥蛋白mRNA表达的影响［J］.山东中医药大学学报，2005，29(3):232.

Expression of VEGF，bFGF，TGFβ1mRNA of Rabbits after Intima Denudation，by the Influence of Supplementing Qi，Nourishing Yin and Removing Meridian Obstruction Method

YANG Ying，LI Wen-jie△
(Affiliated Hospital of Lianning University of TCM，Shenyang 110032，China)

Objective:To observe the expression of VEGF，bFGF，TGFβ1mRNA of rabbits after intima denudation，under the influence of Xinshu injection，which has effects of supplementing Qi，nourishing Yin and removing meridian obstruction.Also，to investigate the mechanism of Xinshu injection preventing and curing the restenosis after PCI operation.Method:The 48 new-zealand big ear white rabbits were randomly divided into 4 groups，A the normal group、B the model group、C Xinshu injection group、D the Atorvastatin group.After 2 weeks，these animals were collected the specimen of abdominal aorta.Besides observing the rabbits’abdominal aorta under the light microscope，and used the RT-PCR to detect the expression of VEGF、bFGF、TGFβ1mRNA of the abdominal aorta.Conclusion:Xinshu injection can prevent and cure the restenosis after PCI operation，its effect is related to the mechanisms that elevate the VEGF expression，while degrade the expression of bFGF、TGF-β1.

Supplement qi nourishing Yin and removing merdian obstruction;Intima Denudation;VEGF;bFGF; TGFβ1;mRNA

R285.5

B

1006-3250(2015)01-0053-03

2014-09-17

辽宁省教育厅资助项目-益气养阴通络法防治PCI术后再狭窄的实验研究(L2012347)

杨 莺(1976-)，女，沈阳人，副主任医师，医学博士，从事动脉粥样硬化及其相关心血管疾病的中西医结合防治与研究。

△通讯作者:李文杰(1964-)，男，丹东人，主任医师，医学博士，从事中西医结合防治心血管系统疾病的临床与研究，Tel:18102456128。