补中益气丸对脾虚大鼠能量物质及AMPK的影响❋

李燕舞，李耿，巫燕莉

(1.广州中医药大学脾胃研究所，广州510405;2.广州中医药大学中药学院，广州510405)

补中益气丸对脾虚大鼠能量物质及AMPK的影响❋

李燕舞1，李耿2，巫燕莉1

(1.广州中医药大学脾胃研究所，广州510405;2.广州中医药大学中药学院，广州510405)

目的:从ATP、AMP、AMPK的变化探讨脾虚证与能量代谢的关系。方法:采用高效液相色谱法检测大黄脾虚大鼠ATP、AMP的变化，荧光定量PCR方法检测AMPK-α基因的表达。结果:脾虚模型血浆、肝组织AMP/ATP均增高;肌肉中AMPK-α基因表达显着降低，肝组织中AMPK-α基因表达显着升高;补中益气丸对上述模型中异常的能量物质有调节作用。结论:脾虚静息状态下ATP、AMP及AMPK在不同组织中表达不同，肝组织能量需求大于肌肉组织，补中益气丸可以调整脾虚状态下紊乱的能量物质。

脾虚证;AMPK;能量代谢;AMP/ATP;补中益气丸

物质代谢是生命的最基本特征，能量代谢是物质代谢过程中所伴随能量的释放、转移和利用，它与中医“脾主运化，脾为后天之本”、“脾主肌肉”等理论密切相关。脾主运化的过程包含着现代医学论述的营养物质吸收过程，是一个主动耗能、不断消耗ATP的过程。脾虚证是中医脾胃病常见的病证之一，若脾虚失运则脏腑、肌肉无以充养，各器官的功能活动则会减退［1］。可见，脾虚证的基本病理机制之一可能与机体脏腑、肌肉能量代谢障碍密切相关。

AMPK(磷酸腺苷活化蛋白激酶，AMP-activated protein kinase)在真核细胞生物中广泛存在，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AMPK能感知细胞能量代谢状态的改变，并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量的供求平衡。作为能量感受器，AMPK通过感知细胞内AMP/ATP比值的变化来调控线粒体功能，从而维持能量稳态［2］。本研究以脾虚大鼠模型为研究对象，从不同组织能量代谢物质ATP、AMP及AMPK的变化探讨脾虚证与能量代谢的关系。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠36只，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供(许可证号SCXK(粤)2008-0002)。饲养于广东省医学实验动物中心及广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房，实验室为国家中医药管理局中医药科研三级实验室。

1.2 试剂

RNAiso Plus(total RNA提取试剂)、逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqII均由TaKaRa公司提供; AMPK及GAPDH引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.3 仪器

高速低温离心机(sigma)，梯度PCR仪(TaKaRa)，TP800荧光定量PCR仪(Bio-Rad)，超微量核酸蛋白检测仪(Thermo Scientific)，超净工作台(苏净安泰)。

1.4 方法

1.4.1 造模及给药大鼠按随机数字表法分为正常对照组、脾虚模型组、补中益气丸治疗组各12只。脾虚模型采用100%大黄水煎液灌胃，灌胃体积1 ml/100 g，每日2次，连续10 d。造模结束后治疗组给予补中益气丸(3 g/kg)，正常对照及模型组均给予等体积蒸馏水，连续7 d。

1.4.2 样品处理腹主动脉采血(抗凝)1 ml，加入等体积7%高氯酸充分混合，4000 r/min离心10 min收集上清;用10%KOH中和至PH为7.0，10000 r/min离心10 min取上清，-80℃保存备用。取肝组织、肌肉组织各约1 g，分别放入含有1.5 ml 7%高氯酸的预冷试管中，依次加入0.5 ml KOH(1 mol/L)，研磨组织，离心3000 r/min×10 min取上清，经0.22 μm微孔滤器过滤后-80℃保存备用。另取肝脏及肌肉组织各1份，-80℃冰箱保存备用。

1.4.3 高效液相色谱法(HPLC)检测色谱条件:色谱柱:Phenomenex-ODS(250 mm×4.0 mm，5 μm);流动相:甲醇∶磷酸盐缓冲液(pH 6.5)(2∶98)，柱温30℃;检测波长:254 nm，流速0.6 ml· min-1，进样量10 μL。线性关系实验及样品测定:用纯净水分别配制梯度ATP、AMP标准溶液，吸取10 μL注入液相色谱仪，按照色谱条件测定，记录峰面积，以峰面积(mA μ×min)为纵坐标，进样浓度(ug/ml)为横坐标，绘制标准曲线得出回归方程及线性系数。

1.4.4RT-PCR检测肌肉及肝组织样品中AMPK-α mRNA含量取0.1 g肌肉或肝脏组织提取总RNA。在超微量核酸蛋白检测仪检测计算样品RNA含量并进行逆转录。AMPK-α引物:5’-TGAGCTTACAGCTTTACCTGGTTGA-3’，5’-CACTT GACCGAGGTCTGTGGA-3’。PCR反应条件:95℃5 s，60℃30 s，72℃45 s，40个循环，分析荧光信号并采用相对定量法中2-△△Ct法计算靶基因表达量。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0，软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 一般状态观察结果

本实验采用大黄型脾虚造模法，该模型在脾虚证的复制应用中已得到较多认可。大黄性苦寒，归脾、胃、肠三经，中医学认为过量和长时间服用苦寒药可导致损伤脾胃。我实验室长期从事脾虚证的相关研究，大黄脾虚模型应用较多，模型动物可见体质量轻微降低、稀便、纳呆、少动扎堆、毛发苦涩等类似临床“脾虚”症状，胃、肠道病理检测未见明显异常。既往研究表明，该模型大鼠胃泌素受体表达显着降低。该模型负荷应激因素可导致动物胃黏膜损伤明显加重，而益气健脾中药对上述症状均有改善作用［3-4］。

2.2HPLC线性实验结果

图1显示，ATP在0.75～75 ug/ml内呈良好线性关系，r为0.9991，回归方程为y=0.2864xΣ 0.54。AMP在0.75～39 ug/ml内呈良好线性关系，r为0.9994，回归方程为y=0.4636x+0.0112。

图1 ATP、AMP标准曲线

2.3 各样本AMP、ATP含量检测结果

表1显示，AMP在肝组织中含量最高，其次是肌肉，再次是血浆。与正常组大鼠比较，脾虚模型大鼠肌肉AMP含量明显降低(P＜0.01)，而血浆、肝组织AMP含量明显增高(P＜0.01);经补中益气丸治疗后，模型组血浆AMP含量明显降低(P＜0.01)，而肌肉组织AMP含量有显着提高(P＜0.05)。

表1显示，ATP在肌肉中含量最高，其次是肝组织，再次是血浆。与正常组大鼠比较，模型大鼠肌肉、肝组织ATP含量明显降低。经补中益气丸干预后，模型大鼠肌肉及肝组织ATP含量均显着增高，提示补中益气丸干预对大黄脾虚模型肌肉、肝组织能量物质的降低有显着逆转作用。

2.4AMP/ATP结果

表2显示，与正常对照组比较，模型组血浆、肝组织AMP/ATP均增高(P＜0.01);经补中益气丸干预后，血浆、肌肉、肝组织AMP/ATP均有下调(P＜0.01)。

2.5AMPK-α基因表达结果

表3显示，与正常对照组比较，脾虚模型肌肉中AMPK-α基因表达显着降低(P＜0.01);而脾虚模型肝组织中AMPK-α基因表达显着升高(P＜0.01);补中益气丸干预后，上述指标均有逆转(P＜0.01)。

表1 脾虚大鼠血浆、肌肉、肝组织AMP、ATP含量变化(μg/ml，±s)

表1 脾虚大鼠血浆、肌肉、肝组织AMP、ATP含量变化(μg/ml，±s)

注:与正常对照比较:##P＜0.01;与脾虚模型比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别鼠数血浆肌肉肝组织正常对照组12AMP12.44±7.21276.97±86.23333.08±170.23〛ATP62.81±20.211143.67±270.43572.66±111.82脾虚模型组10AMP20.72±5.11##97.47±43.13##687.36±292.38##ATP64.25±18.63487.44±181.09##317.03±49.96##补中治疗组10AMP8.79±3.28＊＊131.86±81.40*666.06±149.09 ATP73.63±25.95789.61±176.60＊＊722.85±139.01＊＊

表2 脾虚大鼠血浆、肌肉、肝组织AMP/ATP的变化(±s)

表2 脾虚大鼠血浆、肌肉、肝组织AMP/ATP的变化(±s)

注:与正常对照比较:##P＜0.01;与脾虚模型比较:＊＊P＜0.01

组别鼠数AMP/ATP血浆肌肉肝组织正常对照组120.198±0.0970.253±0.0980.565±0.222脾虚模型组100.340±0.104##0.315±0.0952.144±0.811##补中治疗组100.128±0.059＊＊0.163±0.075＊＊0.928±0.172＊＊

表3 脾虚大鼠肌肉、肝组织AMPK-α基因表达变化(±s)

表3 脾虚大鼠肌肉、肝组织AMPK-α基因表达变化(±s)

注:与正常对照比较:##P＜0.01;与脾虚模型比较:＊＊P＜0.01

组别鼠数AMPK-α基因表达肌肉肝组织正常对照组100.942±0.5151.186±0.368脾虚模型组100.303±0.176##2.767±1.444##补中治疗组100.937±0.236＊＊0.832±0.434＊＊

3 讨论

脾的运化功能与现代医学中营养物质的吸收、转化与代谢过程十分相似，包括葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等分解代谢及能量转化，因此中医“脾”的功能与能量代谢密切相关。AMP、ATP是能量生成和利用系统的桥梁，每种营养物质作为能量来源，被利用的比例取决于机体的组织、饮食和激素状态。有研究表明，脾虚状态下Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性均有所降低，能量产生不足，能源物质匮乏，故临床病人和脾虚证动物出现神疲乏力、肌肉消瘦等症状［5-7］。本研究发现，大黄脾虚大鼠模型肌肉、肝组织中ATP含量明显降低，与文献报道大黄脾虚模型大鼠小肠组织ATP含量降低一致［8］，提示脾虚状态下机体能量物质低下，而益气健脾经典方补中益气丸对此有明显的复建作用。

AMPK作为细胞能量感受器，通过感知细胞内AMP与ATP比值的变化来调控线粒体的功能，从而维持能量稳态。AMP/ATP比值升高会激活AMPK，从而启动分解代谢的信号通路，同时抑制合成代谢的信号通路，提高细胞ATP水平。AMPK由α、β、γ 3个亚单位组成，α亚单位172位苏氨酸(Thr172)的磷酸化是AMPK激活的主要机制［9-10］。有不少研究对“脾”与线粒体、能量代谢的关系进行了探讨，主要集中在对脾虚证线粒体形态改变以及能量代谢相关酶活性的研究［11-12］，尚未见到从AMPK角度分析脾虚证与能量代谢的关系。本研究发现，脾虚状态下，机体肝及肌肉组织能量物质ATP含量均明显降低，AMP/ATP比值有所增高，而AMPK-α基因表达却不同。脾虚模型肌肉中AMPK-α基因表达显着降低，提示AMPK活性有可能下调，能量代谢物质生成减少;而脾虚模型肝组织中AMPK-α基因表达显着升高，AMP/ATP也明显增高，提示AMPK基因及活性增高，能量物质生成增加。可见，脾虚模型不同组织中AMPK表达有所区别，内脏中能量物质的提供优于四肢，符合机体安静状态下的供能需求。补中益气丸作为益气健脾的经典方剂，对脾虚状态下异常的能量代谢物质均有显着调节作用。关于脾虚证与机体能量代谢特别是与AMPK的关系，有待于通过负荷试验进一步深入探讨。

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Influences of Buzhong Yiqi Pill on Energy Substance and AMPK of Spleen Deficiency Syndrome Rat

LI Yan-wu1，LI Geng2，WU Yan-li1

(1．Pi-Wei Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2．School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

Objective:To discuss the relationship of spleen deficiency syndrome and energy metabolism based on the changes of ATP，AMP and AMPK.Methods:Spleen deficiency syndrome rat model was made by intragastric administration of Rheum.ATP and AMP in plasma，muscle and liver were detected by HPLC.AMPK-α expression in muscle and liver were detected by RT-PCR.Results:Compared with normal group，AMP/ATP ratio were increased obviously in the plasma and liver of model group.AMPK-α gene expression in muscle of model decreased obviously but increased in liver.Buzhong Yiqi pill could regulate the abnormal energy substance above in the model group.Conclusions:There are some differences of ATP，AMP and AMPK in different tissues，and energy supply in liver could be more than in muscle in the spleen deficiency syndrome.Buzhong Yiqi pill could regulate the disordered energy substances in the spleen deficiency syndrome.

spleen deficiency syndrome;AMP-activated protein kinase;energy metabolism;AMP/ATP;Buzhong YiqiPill

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0592-03

2015-02-15

广州中医药大学特色重点学科项目(财教［2013］339号)

李燕舞(1976-)，女，陕西西安人，副研究员，医学博士，从事调理脾胃中药的药理研究。