附子注射液对冠心病心脾阳虚证模型大鼠离体心肌的影响*

唐汉庆，卢 兰，李晓华，朱晓莹

(1．右江民族医学院，广西百色 533000;2．惠州市第四人民医院，广东惠州 516055)

【实验研究】

附子注射液对冠心病心脾阳虚证模型大鼠离体心肌的影响
*

唐汉庆1，卢 兰2△，李晓华1，朱晓莹1

(1．右江民族医学院，广西百色 533000;2．惠州市第四人民医院，广东惠州 516055)

目的:观察附子注射液对冠心病心脾阳虚证动物离体心肌的影响。方法:100只Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、附子注射液低剂量、中剂量、高剂量组5组。模型组、低剂量、中剂量、高剂量组采用BAT切除术、高脂饲料喂养、隔日寒冷环境刺激、脑垂体后叶素(10U·kg－1)皮下注射序贯方法造模。造模后低剂量、中剂量、高剂量组以附子注射液干预，观察大鼠肛温、体质量和心功能变化。结果:与正常组比较，模型组肛温、体质量、LVSP、dp/dtmax、－dp/dtmax均下降，LVEDP显着升高。与模型组比较，中剂量组和高剂量组肛温、体质量、LVSP、dp/dtmax、-dp/dtmax均增加，高剂量组LVEDP降低。结论:附子注射液加强心肌收缩性、改善大鼠心脏舒张功能效果与剂量有关，在安全剂量范围内有望成为新强心剂。

附子注射液;冠心病;心脾阳虚证;心肌

冠心病缓慢性心率失常的表现属于中医学“心悸”或“胸痹”范畴，辨证属心阳虚证，在临床中单纯的冠心病心阳虚证较为少见，多累及多个系统或脏器，证型表现为冠心病心脾阳虚证或冠心病心肾阳虚证。附子具有补火助阳、温肾散寒等功效。《本草汇言》指出:“附子，回阳气，散阴寒”，对心、脾、肾阳虚均具有振奋作用，是助阳名药。对附子的研究较多，以其对心血管系统的影响为对象，在有关研究［1］的基础上，本实验首先建立冠心病心脾阳虚证动物模型，并采用不同剂量的附子注射液进行干预，观察其不同剂量对冠心病心脾阳虚证动物心脏功能的影响，探讨其不同剂量的强心作用，为临床开发附子作为安全的强心新剂型提供动物实验参考资料。

1 材料

1.1 动物

清洁级Wistar大鼠100只，雌雄各半，体质量190～285g，由本院科学实验中心提供(动物合格证号SCXK(桂)2011-0003)。

1.2 药物

附子注射液(自制)，水合氯醛(批号20090025，北京化学试剂公司)，脑垂体后叶素(批号990314，上海生物化学公司)。

1.3 仪器

电子天平(AE160型，瑞士Mettler公司);高速低温离心机(PK121R型，ALC公司);超低温冰箱(MDF-U72V型，日本三洋公司);生物信号采集系统(MedLab-U型，上海欣曼公司);Langendorff离体心脏灌流装置、生物机能实验系统及温度传感器、压力传感器和换能器(成都泰盟公司);彩色多普勒超声诊断仪(Vivid7型，美国 GE公司);恒温浴槽(PHDC-8006型，上海方瑞)。

2 方法

2.1 动物分组和造模

大鼠适应性喂养1周后按随机数字表法分为正常组、模型组、附子注射液低剂量组、中剂量组和高剂量组5组，每组20只，雌雄各半。正常组给予普通饲料，自由饮水摄食，常态环境喂养;模型组、附子注射液低剂量组、中剂量组和高剂量组均施行肩胛骨间棕色脂肪组织(brownadiposetissue，BAT)切除术，术后饲以高脂饲料(83%基本饲料，15%甘油三酯，2%胆固醇)，19℃环境喂养。第22天开始皮下多点注射脑垂体后叶素(10U·kg－1)，正常组给予等容量生理盐水，每天1次，连续7d。末次给药心电图检查后取心脏，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别按1ml·kg－1、2.5ml·kg－1、5ml·kg－1剂量进行心脏灌流，正常组和模型组给予生理盐水灌流。

考虑到附子对心血管系统的毒性作用，对附子注射液的剂量，参考研究［2］确定的静脉注射半数致死量(LD50)和研究［3］单体药物人体实验与动物实验给药剂量间等效剂量情况进行折算而确定，将附子注射液剂量定在安全范围内。

2.2 附子注射液制备

熟附片由本校药理教研室提供并鉴定。参考李兰芳等酒精沉淀法制备100%附子注射液，即每100 ml中含有100g生药成分(李兰芳，赵淑云，蓝庆荣，等．附子及其几种制剂中剧毒性生物碱的含量测定［J］．中成药研究，1987(9):13-14)。

2.3 行为学观察

观察大鼠一般生活状况如活动度、摄食行为、毛发改变、体质量变化等。

2.4 肛温、体质量检测

大鼠分组后第1天早晨8点记录每组原始肛温数据和体质量数据。第36天早晨8点再次记录肛温数据和体质量数据。肛温检测方法:大鼠适宜环境温度(28℃)禁食12h后，乙醚麻醉、称重、仰卧固定;连接BL-420E+生物机能实验系统，取少量甘油润滑温度传感器探头，置于肛门内25mm测肛温。

2.5 心电图检查

末次给药后10%水合氯醛按3mL·kg－1腹腔麻醉，连接MedLab-U生物信号采集系统，记录标Ⅱ导联心电图，参考文献［3］心肌缺血阳性标准，具备以下之一为阳性:①ST段水平向下或向上偏移≥0.1 mv;②T波高耸，超过同导联R波的1/2;③T波高耸伴ST段移位。具备以下之一者为阴性:①ST段斜形偏移或水平偏移＜0.1mv;②T波低平或双向倒置。彩色多谱勒超声诊断仪(探头频率为7.5 MHz)检测大鼠心功能，检测左心室舒张早期血流E波峰值流速(E)和舒张末期血流A波峰值流速(A)，E/A＞1为心舒张功能正常，E/A≤1为心舒张功能异常。

2.6 大鼠离体心肌舒缩能力观察

心电图检查后迅速分离心脏，置于氧饱和的37℃台式液中(mmol·L－1:NaCl135;KCl5.4; CaCl21.6;MgCl21.8;NaH2PO40.33;Glucose10; HEPES5;NaOH调pH至7.4)，轻轻挤压心脏，排出残血。迅速将心脏移至 Langendorff装置(恒温37℃)，将压力传感器经左心房插入左心室，通过换能器连接生物机能实验系统自动记录左心室收缩，记录参数(采样频率20kHz，灌流流速10ml· min－1)，待心脏灌流稳定20min后给予附子注射液干预。观察指标为左心室收缩压(LVSP)、左心室终末舒张压(LVEDP)和左心室内压最大上升速率(dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(－dp/dtmax)。

2.7 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，t检验分析组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 结果

3.1 行为学观察

本实验大鼠没有死亡脱失，全部纳入统计分析。造模后，大鼠畏冷寒战、喜扎堆、拱背少动、毛发枯槁，出现食欲不振、倦怠、消瘦、便溏等症状或体征。

3.2 大鼠心电图、心脏指数检测

表1显示，与正常组比较，模型组阳性表现增高，差异有统计学意义(P＜0.01);模型组心脏指数显着升高，差异有统计学意义(P＜0.01);模型组全部例数E/A≤1，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，中剂量组和高剂量组恢复阴性表现，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);中剂量组和高剂量组心脏指数升高，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);中剂量组和高剂量组E/A＞1例数增多，差异有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01)。

3.3 大鼠肛温、体质量变化

表2显示，造模后与正常组比较，模型组肛温及体质量均降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较，中剂量组和高剂量组肛温及体质量均增加，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。模型组造模前后比较，造模后肛温及体质量均降低，差异有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01)。

3.4 附子注射液对大鼠离体心肌舒缩能力的影响

表3显示，与正常组比较，模型组LVSP、dp/dtmax、－dp/dtmax均显着降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，LVEDP显着升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，中剂量组LVSP、dp/dtmax升高，差异有统计学意义(P＜0.05);高剂量组LVSP、dp/dtmax、－dp/dtmax均显着升高，差异有统计学意义(P＜0.01);LVEDP降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 大鼠心电图、心脏指数、E/A变化［例(%)］

表2 大鼠肛温、体质量变化(±s)

表2 大鼠肛温、体质量变化(±s)

注:与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;模型组造模前后比较:5)P＜0.05，6)P＜0.01

组 别 鼠数 剂量/ml·kg－1(ml·kg－1)肛温(℃)体质量(g)造模前 造模后 造模前 造模后正常组 20 — 31.15±2.25 31.46±2.15 262.28±15.54 301.01±11.11模型组 20 — 31.25±2.35 27.14±1.291)，5) 249.44±10.45 159.01± 6.022)，6)低剂量 20 1．0 30.22±2.12 28.44±1.56 248.46±11.66 175.61±6.68中剂量 20 2.5 30.02±2.14 29.24±2.453) 242.23±10.62 240.52±8.513)高剂量 20 5．0 30.76±2.17 32.81±2.883) 254.35±11.95 254.03±10.594)

表3 大鼠离体心肌舒缩能力变化(±s)

表3 大鼠离体心肌舒缩能力变化(±s)

注:与正常组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组 别 鼠数 剂量(ml·kg－1) LVSP(kPa) LVEDP(kPa) dp/dtmax(kPa·s－1) －dp/dtmax(kPa·s－1)正常组 20 — 3.78±0.41 3.88±0.68 124.32±26.11 96.22±25.11模型组 20 — 1.22±0.111) 5.33±0.821) 85.51±16.211) 64.08±19.861)低剂量 20 1 1.26±0.15 4.86±0.78 92.08±19.86 81.44±20.08中剂量 20 2.5 2.02±0.262) 4.72±0.76 102.01±21.862) 88.01±22.35高剂量 20 5 3.66±0.423) 4.02±0.712) 126.78±28.663) 102.54±25.863)

4 讨论

以复合因素、病证结合思维为基础，造模法研制贴近中医科研特点的动物模型值得探讨。冠心病心脾阳虚证动物模型的建立，要考虑既有冠心病心阳虚的症状，也同时要有脾阳虚的表现，本实验进行了初步的尝试工作。

对冠心病心阳虚证的造模方法和冠心病动物模型的客观诊断依据，高脂血症、心电图T波及S-T段改变等已有报道［1］。本实验在此基础上加以改进，采用皮下多点注射脑垂体后叶素，通过心电图观察到模型组在心肌缺血程度、心脏指数、E/A和正常组比较，差异有统计学意义，模型似乎与临床冠心病表现比较接近。

对于脾阳虚证，应既有脾虚症状也有阳虚症状，可概括为两大症状群，即阳虚症状群如畏寒喜温、形寒肢冷等，以及脾虚症状群，表现为纳少、消瘦、乏力、脘腹胀痛、便溏及腹泻等。根据有关脾阳虚证两大症状群的文献评价［4-5］，在以往有关脾阳虚证研究中［6-10］，采用“BAT切除术+高脂饲料喂养+隔日寒冷环境刺激”复合因素方法，并结合大鼠行为学观察、体质量、肛温的测定及评价建立脾阳虚证动物模型。本实验中观察到，模型大鼠大便稀溏、肛门周围有污物、动物蜷伏懒动、喜扎堆、毛稀疏枯槁、无光泽等，同时模型组体质量和正常组比较差异有统计学意义，这些结果为脾虚定性提供了参考依据。

对于阳虚症状，通过采用皮下多点注射脑垂体后叶素、BAT切除术、隔日寒冷环境刺激，加强了脾阳虚证的“伤阳”设计，通过切除BAT，大幅度减少大鼠产热来源和寒冷环境刺激，衰其阳气，使阳虚造模环节更接近于“寒伤中阳”。本实验工作中也观察到，模型组造模后肛温均降低，与造模前比较差异有统计学意义，提示模型动物出现阳虚的病理表现。

附子具有提高窦房结兴奋性、增加心率、改善房室传导、加强心肌收缩力的作用，对心脏具有正性肌力作用［11］。实验结果提示，模型组心肌舒缩能力出现病理变化，采用附子注射液干预后心肌功能得到改善，尽管本次实验结果并不能说明附子注射液加强心肌收缩性、改善大鼠心脏的舒张功能效果与剂量呈正相关性，但至少提示其发挥正性肌力效果与剂量有关系。由于附子本身具有致心律失常的副作用，其剂量应给予重视。本实验剂量的确定主要依据文献［2-3］，推测采用的高剂量并不一定能取得最好效果，如果能找到既避免附子毒副作用又能最大限度发挥其正性肌力作用的注射剂量，就有可能使附子注射液成为临床安全使用的新型强心剂。

［1］ 张明雪，曹洪欣．冠心病心阳虚证动物模型的制作［J］．中国中医基础医学杂志，2002，8(4):71-75．

［2］ 金治萃，田德真，杨煜荣，等．附子注射液对体液免疫影响的初步研究［J］．内蒙古医学杂志，1983，3(1):1-3．

［3］ 黄娟萍，罗裕，江力，等．中药药动学研究中给药剂量的现状分析［J］．中国药学杂志，2012，47(21):1685-1689．

［4］ 杨雪，杨文思，王勇，等．脾阳虚证中阳虚症状群的实验评价［J］．中华中医药杂志，2008，23(3):244-246．

［5］ 杨雪，杨文思，王勇，等．脾阳虚消化不良症状群客观评价的研究［J］．中国中医基础医学杂志，2008，14(4):271-272．

［6］ 唐汉庆，张文通，王勇，等．脾阳虚证大鼠胃生长素改变的研究［J］．中国中医基础医学杂志，2010，16(12):1136-1137．

［7］ 吴云起，唐汉庆，吴翠松，等．脾阳虚证大鼠棕色脂肪组织和解偶联蛋白1关联性的实验研究［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(14):206-210．

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［9］ 唐汉庆，张文通，卢阿娜，等．附子理中丸对脾阳虚证大鼠骨骼肌能荷影响的实验研究［J］．中国药师，2010，13(12): 1691-1694．

［10］ 张文通，唐汉庆，卢阿娜，等．附子理中丸对脾阳虚证大鼠骨骼肌肌球蛋白ATP酶活性的影响［J］．中华中医药杂志，2011，26(3):490-494．

［11］ 高天礼，庄宏．附子Ⅰ号对抗小鼠实验性缓慢型心率失常的作用［J］．中医杂志，1980(10):71-72．

EffectofAconiteInjectiononMyocardialofSpleenYangDeficiency RatsModelofCoronaryHeartDisease

TANGHan-qing1，LULan2，LIXiao-hua1，ZHUXiao-ying1
(1．YoujiangMedicalUniversityforNationalities，GuangxiBaise533000，China; 2．theFourthPeople'sHospitalofHuizhouCity，GuangdongHuizhou516055，China)

ObjectiveToobservetheeffectsofFuziinjectiononinvitromyocardiuminratswithcoronaryheartdisease duetoheartandspleenyangdeficiencysyndrome．Methods100Wistarratsweredividedintocontrolgroup，modelgroup，Fuziinjectionlow-dosegroup，middle-dosegroupandhigh-dosegroup．Themodelgroup，low-dosegroup，middle-dose groupandhigh-dosegroupwereappliedincisingBATthenwithhighfattydietandcoldstimulationeveryotherday，and subcutaneousinjectionwithpitutrin，thentoobserverectaltemperature，weight，indexesofheartfunction．Results Comparedwiththecontrolgroup，rectaltemperature，weight，LVSP，dp/dtmax，－dp/dtmaxinthemodelgroupallreduced whileLVEDPincreasedsignificantly．Comparedwiththemodelgroup，rectaltemperature，weight，LVSP，dp/dtmax，-dp/ dtmaxinthemiddle-dosegroupandhigh-dosegroupincreasedwhileLVEDPinthehigh-dosegroupreduced．Conclusion: Fuziinjectionmayreinforcemyocardialcontractionandimprovediastolicfunction，whichmightmakeitbecomenew cardiotonicwhenusedinasafedoserange．

Fuziinjection;Coronaryheartdisease;Heartandspleenyangdeficiencysyndrome;Myocardium

R541．4

:B

:1006-3250(2015)08-0933-03

2015-02-18

广西高校优秀人才资助计划项目-附子理中汤对脾阳虚证大鼠心脏电生理活动影响的实验研究［桂教人(2011)40号］

唐汉庆(1976-)，男，广西合浦人，副教授，医学博士，硕士研究生导师，从事民族医药与中西医结合基础研究。

△通讯作者:卢 兰，主治医师，医学学士，从事中西医结合呼吸内科的临床与研究，Tel:0752-2583012，E-mail: 85781814@qq．com。