补肾活血法对肾虚血瘀型大鼠雌、孕激素及其受体的影响*

冯玉霞，王田平，曾 倩△，王 毅，黄金珠，邓琳雯，韩雪梅

(成都中医药大学附属医院，成都 610072)

补肾活血法对肾虚血瘀型大鼠雌、孕激素及其受体的影响*

冯玉霞1，王田平1，曾 倩1△，王 毅2，黄金珠2，邓琳雯3，韩雪梅3

(成都中医药大学附属医院，成都 610072)

目的:探讨补肾活血法对肾虚血瘀型大鼠雌孕激素及其受体的影响。方法:选动情前期大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、补肾活血方药低剂量组、高剂量组和五子组造肾虚血瘀模型，妊娠第4天处死大鼠，留取血清及子宫标本，放射免疫法测定血清雌二醇(E2)、孕酮(P)，免疫组化结合图像分析系统检测子宫雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)含量。结果:模型组E2、P、ER、PR明显低于空白组;各治疗组E2和P、高剂量组ER和PR、低剂量组和五子组的PR比模型组明显升高。多元相关性分析，ER、PR与E2呈正相关，间质PR与P呈正相关。结论:补肾活血法可升高肾虚血瘀型大鼠E2、P水平，调控ER、PR表达，利于子宫内膜成熟及胚泡着床。

补肾活血法;雌激素;孕激素;雌激素受体;孕激素受体;子宫内膜容受性

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级健康SD未交配雌性大鼠70只，体质量190～240 g，同品系有生育能力雄性大鼠16只，体质量250～280g，购自成都中医药大学实验动物中心(合格证号scxk(川)2008-11)。雌雄分笼饲养，给予12 h光照、12 h避光，室内温度(22±1)℃，相对湿度约为40%，给予标准饲料和饮用水。

1.2 药物

补肾活血方药(即助孕I号方)制备:菟丝子、枸杞子、覆盆子、丹参等(由成都中医药大学附属医院制剂室提供，批号20130327)按一定比例制成含生药3.14 g/ml的无菌煎剂，置4℃冰箱冷藏备用;羟基脲片:北京嘉林药业股份有限公司(批号130203);高分子右旋糖苷:上海金穗生物科技有限公司(批号JS11715);五子衍宗丸:太极集团四川绵阳制药有限公司(批号1306011)。

1.3 试剂及器材

E2(批号RG61312)、P(批号RG51312)放免试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司;一抗ER (克隆号 6136518，兔抗鼠多克隆抗体)购自BeacomBio公司;PR(克隆号Y-B4-07C17B，兔抗鼠多克隆抗体)购自武汉博士德生物工程有限公司，二抗及相应试剂盒购自北京中杉生物有限公司; BX43正置显微镜购自 OLYMPUS公司(型号BSA224S-CW)。

1.4 分组及建立模型

参照《动物试验方法学》［7］，选择阴道涂片显示为动情前期大鼠50只，按随机数字表法分为空白组、模型组、补肾活血方药低剂量组、高剂量组和五子组。建立肾虚血瘀型大鼠模型［8-10］:空白组给予蒸馏水5 ml/kg灌胃，其余各组给予羟基脲450 mg/ (kg·d)连续灌胃8 d，空白组、模型组给予蒸馏水5ml/kg灌肠，低剂量组、高剂量组分别给予补肾活血方7.3 g/kg、14.6 g/kg灌肠，五子组给予五子衍宗丸溶液1.68 g/kg灌胃。第9天以后早晨9∶00阴道涂片，若发现膨大的上皮细胞核消失，成为鳞状脱落的角化上皮细胞，并聚集像许多落叶堆积占细胞的绝大多数，白细胞和有核上皮细胞很少，认为动情期则选各组动情期雌鼠按雌雄2∶1合笼，次日早晨9∶00阴栓或阴道涂片发现精子认为合笼成功，记为妊娠第1天，继续给药至妊娠第4天，末次给药后1 h尾静脉快速推注高分子右旋糖苷5 ml/kg。

施肥器主要采用不锈钢材料制成，料仓等部件采用ABS工程塑料，保证产品强度的同时也使得产品质量较轻易于携带。施肥器整体结构简单，结实耐用，易于维修维护，大大降低了产品成本。下料量、踏板高度均可进行调节，可以满足不同作业需求。把手加设软性胶垫，使手部操作更加舒适。其工作效率明显高于无专项农具辅助的手工作业，作业成本又大幅度低于大型机器，而且适应各种复杂环境，造型简洁大方，价格低廉，多数农户都可以接受，此设计方案应有较好的市场前景。

1.5 检测血清E2、P水平

末次给高分子右旋糖苷30 min后股动脉取血，取上清液用放射免疫分析法测定血清E2、P水平。

1.6 检测子宫内膜ER、PR含量

取血后脱颈处死大鼠，剖腹取出子宫放入FAA液固定，逐级酒精脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片，切片厚度4 um，子宫切片做免疫组化染色，操作按照说明书进行。ER、PR免疫组化结果判定，ER、PR阳性物质呈棕黄色、黄色、浅黄色颗粒状或细丝状，阳性物质表达于胞浆、胞核。光镜下观察切片，先在低倍(100×)下选取5个上皮、间质阳性物质表达最明显区域，然后在中倍(200×)视野下摄入上述5个区域图像，采用Mias-2000图形图像分析系统(四川川大智胜软件股份有限公司)分别测量上皮、间质ER、PR积分光密度，求5个区域积分光密度总和，分别表示上皮、间质ER、PR含量。

1．7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，若2项检验均符合则采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，对不满足任一检验的数据，采用非参数统计中多个独立可Kruskal-Wallis H检验统计处理，组间比较采用Mann Whitney U法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠妊娠第4天血清E2、P比较

表1显示，与空白组比较，模型组E2、P均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，补肾活血法高、低剂量组、五子组E2明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，高剂量组P明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，低剂量组、五子组P升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠妊娠第4天血清E2、P比较(±s)

表1 各组大鼠妊娠第4天血清E2、P比较(±s)

注:与空白组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组 别 鼠数 雌二醇(pg/ml) 孕酮(ng/ml)空 白 组10 26.73±3.01 78.28±19.27模 型 组 10 11.00±3.26＊＊ 39.88± 2.83＊＊低剂量组 10 19.48±6.05▲▲ 61.08±14.19▲高剂量组 10 21.80±2.73▲▲ 75.41±19.42▲▲五 子 组 10 18.96±5.56▲▲ 63.27±20.68▲

图1 各组大鼠妊娠第4天ER免疫组化染色(×200)

2.2 各组大鼠妊娠第4天ER、PR比较

图1、2显示，在光镜下观察ER、PR在大鼠子宫内膜组织上皮、间质均有表达，空白组上皮、间质ER表达呈棕黄色、黄色，分布密集，面积广;模型组上皮、间质ER、PR表达呈黄色、浅黄色，分布稀疏，面积较小;与模型组比较，低、高剂量组和五子组ER、PR表达均有不同程度的增加，呈棕黄色、黄色，分布密集，面积广。

表2显示，与空白组比较，模型组ER、PR表达均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，高剂量组ER和PR、低剂量组和五子组的PR表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05);高剂量组ER表达高于低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图2 各组大鼠妊娠第4天PR免疫组化染色(×200)

表2 各组大鼠妊娠第4天ER、PR比较(±s)

表2 各组大鼠妊娠第4天ER、PR比较(±s)

注:与空白组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:▲P＜0.05，与剂低量组比较:◆P＜0.05

组 别 鼠数 ER 积分光密度总和 PR 积分光密度总和上皮 间质 上皮 间质空 白 组 10 34165.28±6948.37 78513.04± 7805.07 54463.89±36090.88 57665.89± 7494.60模 型 组 10 23876.39±3856.66＊＊ 59270.54± 6332.64＊＊ 36090.8±12321.30＊＊ 41709.40±12394.70＊＊低剂量组 10 28222.86±3078.15 62765.79±11812.11 48566.19± 6630.18▲ 52089.59± 5561.43▲高剂量组 10 30821.62±4123.59▲ 72398.86±10309.16▲◆ 49325.08± 8370.49▲ 53548.17± 7893.27▲五 子 组 10 26617.64±3272.87 59285.16± 8430.48 48151.89± 3749.00▲ 51814.19± 6693.76▲

2.3 多元相关性分析

表3显示，上皮和间质的ER、PR与E2水平呈正相关，间质PR与P水平呈正相关，上皮与间质ER、上皮PR与P无直线相关关系。

表3 各组大鼠妊娠第4天上皮和间质ER、PR与E2、P多元相关性分析

3 讨论

子宫内膜容受性［11］是指子宫内膜处于一种允许囊胚定位黏附侵入并使内膜间质发生改变，从而导致胚胎着床的状态。在着床期，子宫内膜在雌、孕激素作用下发生一系列与胚泡发育同步，并有利于胚泡着床的形态结构变化，对胚泡具有容受性，能使胚泡顺利着床［12］。雌、孕激素通过各自的细胞内受体作用于内膜组织，使子宫内膜腺体和间质增生发育，为胚胎着床提供物质基础。研究发现［13］，COH明显干扰了子宫内膜腺上皮ER、PR的正常表达，使内膜腺上皮细胞ER、PR的阳性细胞表达率下降，影响子宫内膜胞饮泡的正常发育，致内膜发育延迟，也影响子宫内膜发育的成熟度。本实验发现，模型组E2、P、ER、PR比空白组明显降低，说明肾虚血瘀会导致E2、P分泌降低，抑制ER、PR表达，影响子宫内膜的形态、功能，降低子宫内膜容受性，从而影响胚胎着床。补肾活血法低、高剂量组和五子组的E2、P比模型组高，高剂量组的ER和PR、低剂量组和五子组的PR表达比模型组升高，说明补肾法和补肾活血法可升高E2、P水平，改善肾虚血瘀对ER、PR表达的抑制，增加ER、PR在子宫内膜表达，改善子宫内膜容受性。

研究［14］发现，血清E2与子宫内膜ER、PR表达呈正相关，有刺激ER、PR合成的作用，血清P与ER、PR表达呈负相关，抑制ER合成，并间接抑制PR合成的作用。而腺上皮的PR下调和间质细胞P上调的失败是导致子宫内膜容受性下降的原因之一［15-16］。刘子霞［17］等研究发现，IVF-ET助孕患者妊娠组P可下调腺上皮PR和上调间质PR表达，非妊娠组P下调腺上皮PR失败的结果一致。本试验发现，用药组E2、P、ER、PR明显高于模型组，且低于空白组，但差异无统计学意义。多元相关分析发现，E2与ER、PR呈正相关，P与间质PR呈正相关。由此可以推测，补肾活血法可升高E2、P，E2、P上调上皮、间质ER和间质PR表达，使E2、P、ER、PR提高到正常范围内，促进子宫内膜蜕膜化，从而改善子宫内膜结构、功能，提高子宫内膜容受性，促进着床。

中医学无“子宫内膜容受性”相关概念，根据“子宫内膜容受障碍”证候属于“不孕症”“滑胎”“胎漏、胎动不安”“月经失调”等范畴，与“肾气”“气血”有密切联系［18］。前期研究已证实，其主要为肾虚血瘀证。现代医家认为［19］，肾阴是卵泡的物质基础，肾阳是促使其生长发育以及黄体形成的动力。若肾虚则胞宫胞脉失于濡养，血瘀则胞宫胞脉血行瘀滞不畅，胞宫受纳失常，妨碍妊娠。现代药理研究，杨鉴冰［20］临床研究证明，补肾中药有促进黄体功能的作用，且能直接或间接作用于卵巢，促使P合成和分泌，提高和延长P分泌高峰期。有研究发现［21］，资冲颗粒直肠给药和灌胃给药均具有促进幼龄大鼠卵泡发育的作用和增加雌激素样效应。张明敏［22］实验研究发现，将补肾法和活血法结合起来的补肾安胎方可提高E2、P及促进PR、ER表达，能更大程度上改善着床障碍小鼠子宫内膜容受性，促进胚泡着床。补肾活血方通过补肾中阴阳、活血通络使胞宫胞脉得以滋养，胞脉胞络血行畅达，两精相搏，使胞宫受纳才能妊娠。

补肾活血方药由菟丝子、枸杞子、覆盆子、丹参等组成。研究证实，菟丝子含有糖类、黄酮类化合物等，有雌激素样活性［23］;覆盆子能调控下丘脑-垂体-性腺功能［24］;枸杞子具有抗氧化、抗衰老、免疫调节以及保护生殖系统的作用［25］;丹参能改善微循环，促进血液流速，能改善血液流变性，降低血液黏度，抑制血小板聚集和凝血功能，激活纤溶，对抗血栓形成［26］。全方配伍可促进E2、P分泌和ER、PR表达，改善微循环障碍，对肾虚血瘀型大鼠有疗效。

综上所述，补肾活血法可以改善肾虚血瘀型大鼠的子宫内膜容受性，其作用机制可能是升高E2、P水平，调控ER、PR表达，利于子宫内膜成熟和胚泡着床。

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Effect of Bushen Huoxue Method on Estrogen，Progesterone and Its Receptor in Rats with Kidney Deficiency and Blood Stasis

FENG Yu-xia1，WANG Tian-ping1，ZENG Qian1△，WANG Yi2，HUANG Jin-zhu2，DENG Lin-wen3，HAN Xue-mei3
(The Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China)

Objective:To study the effects of tonifying the kidney and promoting blood circulation on estrogen and progesterone and their receptors in rats with kidney deficiency and blood stasis type．Method:the proestrus rats were randomly divided into blank group，model group，both low and high dose group of Bushen Huoxue recipe and the five sub group，made of kidney deficiency and blood stasis model，and killed on day 4 of pregnancy．Samples of their serum and uterine were collected for detecting serum estradiol(E2)，progesterone(P)using radioimmunoassay;and endometrial expression contents of their receptors，ER and PR using immunohistochemistry and image analysis system．Results:E2，P，ER and PR of the model group were significantly lower than blank group;E2and P of the treatment group，ER and PR of high dose group，PR of low dose group and five sub group increased than the model group．Multivariate correlation analysis，ER，PR and E2were positively correlated，interstitial PR and P were positively．Conclusion:tonifying kidney and promoting blood circulation can improve E2，P level of kidney deficiency and blood stasis rats，and regulate the expression of ER，PR to improve endometrial maturation so as to conducive to blastocyst implantation．

Tonifying the kidney and promoting blood circulation;Estrogen;Progesterone;Estrogen receptor; Progesterone receptor; Endometrial receptivity

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0191-04

2015-06-24

四川省教育厅科研基金资助项目(13ZA0284)-基于细胞外机制分子网络研究补肾活血法改善子宫内膜容受性的作用机理;成都市科技局科研基金资助项目(H2013050)-助孕I号方经直肠给药对肾虚血瘀模型大鼠生殖功能的调控机制研究

冯玉霞(1987-)，女，甘肃人，医学硕士，从事不孕症的中医药防治与研究。

△通讯作者:曾 倩(1965-)，女，主任医师，从事不孕症、围试管婴儿期调治、复发性流产、月经不调等疾病的中医药防治与研究，Tel:13488936756，E-mail:zqan999d@126．com。