羌活提取物对热敏通道TRPV1的影响❋

刘珍洪，高 琳，汪文来，赵红霞，高 蔚，安致君，郭 蓉，吴丹桐，Michael Xi Zhu，杨 桢△

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；3.美国德克萨斯大学休斯顿健康科学中心，休斯顿，美国 77030)

【方药研究】

羌活提取物对热敏通道TRPV1的影响❋

刘珍洪1，高 琳1，汪文来2，赵红霞2，高 蔚1，安致君1，郭 蓉1，吴丹桐1，Michael Xi Zhu3△，杨 桢1△

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；3.美国德克萨斯大学休斯顿健康科学中心，休斯顿，美国 77030)

目的：探讨羌活水提物和醇提物对热敏通道TRPV1的影响。方法：在瞬转人源TRPV1的HEK293细胞上，运用膜片钳技术测量羌活提取物对细胞跨膜电流的影响。结果：羌活提取物可激活TRPV1通道产生明显的跨膜电流，该跨膜电流与TRPV1激动剂辣椒素诱发的电流在电流密度和电流-电压关系各方面均类似；羌活水提物在生药1 g/ml时稀释10倍左右，对跨膜电流的影响达到最大，并可以被TRPV1竞争性抑制剂辣椒素完全阻断。结论：羌活提取物中含TRPV1激动剂，该通道活化后产生的系列效应可能是羌活解表、止痛的重要分子机制。

羌活; 热敏通道 TRPV1; 激动剂;解表;止痛

羌活是常用解表中药，《神农本草经》中羌活与独活不分，言其有“止痛”作用。唐·《新修本草》将羌活、独活分列。唐·《药性论》言羌活“味苦，辛”。羌活有浓郁的芳香气味，《中药学》将其功效概括为解表散寒、祛风湿、止痛，其药性符合香草酸受体(TRPV1)激动剂的特征。TRPV1为具有钙离子通透性的非选择性阳离子通道，主要分布在属于伤害性感受器类型的感受神经元及其神经末梢的细胞膜上。作为热敏通道[1]，TRPV1在正常情况下主要为大于43°C的高温所激活导致热痛，同时也参与体温调节。病理状态下，组织酸化、身体发热、多种炎症因子的产生也能引起TRPV1通道的活化[2]，造成炎症痛。作为介导外周疼痛的主要通道之一，TRPV1的激动剂常常是痛觉敏化剂，但也因敏化引起的脱敏而可以作为镇痛剂。现已证明，众多辛味中药和食品可以激活TRPV1通道，其中辣椒素(Capsaicin)是研究TRPV1最常用的激动剂。因此，TRPV1被称为辣椒素受体。中医临床以及动物行为学已经证明，羌活有很好的止痛作用[4-5]，然而其分子机制并不清楚，我们推测羌活可能通过TRPV1通道发挥药效。本研究使用羌活的水提物和醇提物，在转染TRPV1的HEK293细胞上，使用膜片钳技术，对细胞跨膜电流进行了测试，以确定羌活对TRPV1通道的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

中药羌活(2016年3月购自北京同仁堂药店)、TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)、质粒GFP(北京爱思益普生物科技股份有限公司)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、Capsazepine、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calcium chloride(Sigma)。

1.2 仪器

EPC-10 Quattro膜片钳放大器(Heka，德国)、PatchMaster数据获取软件(Heka，德国)、P-97拉制仪器(Sutter Instruments，美国)、IGOR-Pro分析软件(WaveMetrics Inc，美国)、300克密封型摇摆式粉碎XL-06B(广州市旭朗机械设备有限公司)、旋转蒸发器RE-52(上海虹昕电子仪器仪表有限公司)、数显恒温水浴锅HH-6(常州润华电器有限公司)、SHZ-III型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 羌活提取物制备 75%乙醇提取物的制备：称取80 g羌活用粉碎机粉碎成粉末，加入8倍量的75%乙醇与之混合，浸泡30 min，95℃恒温水浴锅上回流提取器回流提取2 h，冷却至室温后双层滤纸过滤，收集滤液，剩余的药渣用于再次提取。重复提取1次，合并2次提取的滤液置于旋转蒸发器上回收乙醇，所得的膏状物(不含乙醇)用双蒸水调浓度至2 g/ml分装，-20℃避光保存备用。实验时用细胞外液稀释100倍(即20 mg/ml)。水提物的制备：称取50 g羌活加8倍量双蒸水浸泡30 min，大火加热至沸腾，文火保持微沸30 min，待冷却后倾出药汁，剩余的药渣加5倍量双蒸水再次煎煮，合并2次药汁双层滤纸过滤，99℃恒温水浴锅加热浓缩调浓度为1 g/ml，3500 r/min离心15 min后取上清液即得羌活水提物，分装，-20℃避光保存备用。实验时用细胞外液按照1∶5、1∶10、1∶20的浓度进行稀释。

1.3.2 细胞培养和转染(HEK293/TRPV1) 本实验所用细胞株为人胚肾293细胞(Human Embryonic Kidney 293 cells，HEK293)。质粒是根据GenBank所载基因信息构建：Homo sapiens transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1 (TRPV1)，transcript variant 1，GenBank 的保藏号NM_080704.2。细胞培养用含10%胎牛血清的培养基。转染前24 h将细胞植于直径12 mm细胞爬片中并置于细胞培养皿中，于37℃培养箱培养。在转染前换为不含抗生素的培养基，置于培养箱中预热。将转染试剂Lipofectamine2000，质粒与稀释液DMEM在室温下平衡15 min至20℃左右，使用无血清的DMEM将转染试剂稀释至终浓度为5 μL转染试剂/100 μL DMEM，使用无菌管稀释轻柔混匀。将2 μg TRPV1质粒和600ng GFP质粒共同加入100 μL转染试剂稀释液中，轻柔混匀后将转染试剂、DNA复合物于15～20℃下静置15 min。从培养箱中取出预热的细胞培养皿，将转染试剂、DNA复合物逐滴加入，转染后4 h换成完全培养基(无双抗)，孵育细胞24～72 h内进行电生理检测。

1.3.3 全细胞膜片钳实验 实验在室温20～25℃下进行，将细胞爬片放置于专门的记录小室中，固定浴液电极。显微镜下选取外形完整、形状规则、边缘整齐、表面光滑无颗粒、横纹清晰、无收缩的长杆状细胞。膜片钳放大器系统通过A/D和D/A数据转换器与计算机进行连接，PatchMaster软件控制相关的刺激信号以及电流、电压信号的采集。玻璃微电极拉制仪拉制玻璃毛胚成尖端直径1～1.5 μm的玻璃微电极，灌入电极内液后安装于电极夹持器上与探头和放大器联通。显微镜观察下用三维操纵仪调节电极尖端的位置使其移向细胞表面，轻压细胞微变形，1 ml注射器负压吸引封接细胞，形成高阻封接(Giga seal)至1 GΩ以上，完成封接后进行电极电容补偿。观察1～2 min，如果不能自行破膜则用1 ml注射器负压吸引破膜，形成全细胞的记录模式。对全细胞膜电容进行补偿后给予相应的测试程序进行信号采集。采样频率为10 kHz。

电极内液成分为CsCl 140 mmol/L， CaCl25 mmol/L， ATP-Mg 1 mmol/L， HEPES 10 mmol/L， EGTA 10 mmol/L， MgCl22 mmol/L，用CsOH 调至pH值 7.2。自由Ca2+浓度维持在85 nmol/L。电极外液成分为NaCl 140 mmol/L， KCl 5 mmol/L， MgCl22 mmol/L， CaCl22 mmol/L， HEPES 10 mmol/L， glucose 5 mmol/L，用NaOH 调至pH 7.4。细胞维持电压(holding potential,Vhold)设定为-80 mV，在Vhold的基础上间隔1 s给予细胞一个从-100 mV到+100 mV连续电压斜坡(voltage ramp)刺激(图1-B)或-80 mV电压下连续记录。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 羌活醇提物对TRPV1转染HEK293细胞的影响

图1显示，在对羌活75%乙醇提取物的研究中，将羌活醇提物用正常TRPV1细胞外液按1∶100稀释，测试羌活醇提物(20 mg/ml)对表达TRPV1细胞跨膜电流的影响，细胞外液为阴性对照，1 μmol/L辣椒素(capsaicin)引起的电流作为阳性对照。实验时先加细胞外液观察电流的基线水平，稳定后滴加测试样品，当电流达到峰值下降后用细胞外液进行洗脱(wash)，使电流恢复至给药前状态(基线水平)，最后滴加阳性药1 μmol/L辣椒素对比其诱导的跨膜电流(图1-A)。细胞电容(pF)代表细胞的大小，每个细胞的大小不一，故数据统计用+100 mV电压下电流密度(=跨膜电流/细胞电容)(pA/ pF)。电流增大倍数=测试样品跨膜电流/细胞外液基底跨膜电流。对辣椒素活性百分比(%)=测试样品跨膜电流/辣椒素跨膜电流100%。结果显示，与正常细胞外液比较，羌活醇提物能诱导表达TRPV1细胞产生明显的跨膜电流(图1-C，羌活醇提物，206±47 pA/pF，n=10，细胞外液，57.6±7.2pA/pF;n=10；P<0.01)。羌活醇提物诱导的电流增大倍数为(3.4±0.6,图1-D，n=10，P<0.01)，是1 μmol/L辣椒素诱导的电流增大倍数(7.9±1.2，n=10，P<0.001)的一半左右。在与1 μmol/L辣椒素诱导的跨膜电流比较中发现，羌活醇提物诱导的电流与细胞外液中检测到的基底跨膜电流存在明显差异(图1-E，羌活醇提物60±14，细胞外液(20±7%，P<0.01)。综上，羌活醇提物具有激活热敏通道TRPV1产生跨膜电流的效应。

图1 羌活醇提物与辣椒素对转染TRPV1的HEK293细胞全细胞电流影响注：A.+100 mV(空心点)和-100 mV(实心点)电压下跨膜电流时程图。a、b、c显示图B中电流-电压(I-V)曲线代表的时间点；B.在细胞外液(a)、羌活醇提物峰值b、辣椒素峰值c点用电压斜坡(voltage ramp)检测到的I-V关系曲线；C-E.各组+100 mV电压下电流密度(C)、电流增大倍数(D)和E对辣椒素活性百分比(E)统计图(Mean±SEM)；组间比较：**P<0.01，***P<0.001

2.2 羌活水提物浓度效价以及辣椒平对其抑制作用

图2、3显示，在对羌活水提物的研究中，将羌活水提物与细胞外液按1∶5、1∶10和1∶20的比例稀释，测试这3个浓度羌活水提物对表达TRPV1的HEK293细胞跨膜电流的影响。结果显示，1∶10稀释即可产生最大的跨膜电流。在稀释到1∶20的时候，跨膜电流已经非常小。为进一步证明水提物对TRPV1的作用，使用TRPV1的竞争性拮抗剂辣椒平(10 μmol/L)与羌活水提物同用，证明可完全抑制同一稀释浓度羌活水提物(1∶10)诱导的跨膜电流。

图2 羌活水提物3个不同稀释浓度在同一细胞与辣椒素(30 M)诱导的跨膜电流比较注：图示-80 mV电压下连续记录的跨膜电流时程。

图3 TRPV1通道竞争性拮抗剂辣椒平(capsazepine)完全阻断了羌活水提物(1∶10稀释)诱导的跨膜电流注：-80 mV电压下连续记录

3 讨论

羌活是辛温解表药且“气味雄烈”，功效为祛风胜湿止痛。行为学研究证实，羌活有很好的止痛作用[6-9]。本研究使用羌活水提、醇提物尝试了解羌活的可能分子靶点。膜片钳数据显示，羌活混合物具有明确的TRPV1激动剂效应，该效应能够被TRPV1的竞争性拮抗剂阻断，因此羌活中含有明确的TRPV1受体激动剂成分。

前期的研究中我们已经讨论了TRPV1通道对恶寒发热的影响机制[10]。恶寒发热涉及到体温变化。人体温度调节由一个多传感器、多效应器的系统完成[11-12]。体温调节系统发挥整体功效由相互独立的多个效应器环相互协调完成，每一个热效应器环都是由1个惟一的传入神经通路和受其支配的感受器构成[13]，而TRPV1在启动这类热效应器时发挥主导作用[12-14]。辛味中药产生的温热感可以直接抵抗环境或感染诱发的寒战，现以证明不少辛味中药对TRPV1有激动效应。在疼痛感知方面，瞬时受体电位(TRP)离子通道家族的3个成员即TRPV1、TRPM8和TRPA1 是寒热和化学刺激激活感觉神经元产生急性或持续性疼痛的分子探测器，这些受体的激动剂或抑制剂在止痛方面发挥着重要作用[15]。

在浓度与药效的关系方面，本研究使用水提物的3个不同浓度对跨膜电流的影响显示，在室温下峰值电流在1∶10左右最大，当浓度稀释达到1∶20的时候，跨膜电流几乎消失。但有鉴于TRPV1为热敏感通道，其对激动剂的敏感度会随着温度提高而增加许多，因此在正常体温下激活TRPV1通道对于羌活的浓度要求应该会低很多。

基于目前对TRPV1的研究，我们已经可以很好地理解《中药学》中的羌活以及《方剂学》中含羌活方剂的功用。以目前《方剂学》教材为例，在败毒散、九味羌活汤、羌活胜湿汤和川芎茶调散等4个使用羌活的方剂中，作为汤剂使用，羌活的推荐用量是6～10 g。以水煎剂400 ml每天计算，羌活的生药浓度在1∶40～1∶67之间。以此推断，羌活在方剂中极有可能单独发挥作用，但也不排除需赖于其他药物的协同作用。这种协同性在相须配伍的方式中可能体现在辛味相近的中药中含有一样的化学成分，多药同用的时候形成量的叠加，进而发挥应有作用。相须配伍的另外一个方式，可能就是多种化学成分作用于同一靶点。以TRPV1通道的激动剂为例，前者如川芎、藁本都含川芎内酯，后者如吴茱萸和生姜所含的不同成分都是TRPV1受体激动剂。

败毒散是重要的解表剂，主治气虚外感证，可见“憎寒壮热”，羌活、独活是其君药。恶寒发热是表证的特征性症状，除败毒散外，九味羌活汤也是治疗外感风寒湿而致身疼痛的重要方剂。《方剂学》中另外还有川芎茶调散、大秦艽汤、羌活胜湿汤含有羌活，它们都发挥祛风湿止痛的作用。现具有批准文号的中成药中，含羌活的处方有441个之多，基本上属于解表、退热、祛风湿、止痛类[16]。TRPV1在感染性疾病恶寒、发热的途径中发挥着重要作用[10]，羌活活化TRPV1可能是败毒散等方药解表作用实现的重要途径之一。

在本研究中，我们首先报道羌活的水提物和醇提物都能激活TRPV1，在细胞和分子层面上对羌活的药效有了进一步的了解。羌活含有众多的化学成分[17]，2010版《中国药典》将羌活中的羌活醇和异欧前胡素含量作为羌活饮片的质控标准。在这些化学成分中，尚无文献记载单体活性成分可以活化TRPV1通道。在类似的结构中，与羌活功效类似的白芷，其含有主要药性成分欧前胡素(Furanocoumarin imperatorin)，能够活化TRPV1通道。进一步膜片钳证据显示，羌活中存在未经报告的激动剂(数据待发)。

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Effects of Notopterygium Incisum Extracts on the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 of Thermosensitire Channel

LIU Zhen-hong1, GAO Lin1, WANG Wen-lai2, ZHAO Hong-xia2, GAO Wei1, AN Zhi-jun1, GUO rong1, WU Dan-tong1, Michael Xi Zhu3Δ, YANG Zhen1Δ
(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2.InstituteofBasicTheory,ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 3.DepartmentofIntegrativeBiologyandPharmacology,UniversityofTexasHealthScienceCenteratHouston,Houston,TX77030,USA)

Objective: To investigate the effect of ethanol extracts and water extracts ofNotopterygiumincisum on thermosensitive channel, Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1). Methods: Whole cell voltage clamp technique was used to record transmembrane currents induced by theNotopterygiumextracts in HEK 293 cells that expressed human TRPV1. Results: Both ethanol and water extracts ofNotopterygiumincisum evoked robust currents comparable to that by the known TRPV1 agonist, capsaicin, in current density and current-voltage relationship. The maximum effect ofNotopterygiumwater extracts was reached at 100 mg/ml. TheNotopterygium-inducedTRPV1 current was completely abolished by the specific TRPV1 antagonist, capsazepine (10 μM). Conclusions: One or more components ofNotopterygiumextracts are TRPV1 agonists, which may underlie the analgesic and relieving exterior syndrome effects ofNotopterygium. Key words:Notopterygiumincisum; Thermosensitive channel; TRPV1; Relieving exterior syndrome; analgesic

国家自然科学基金面上项目(81573847)-基于热敏通道的交叉脱敏探讨理中丸、小建中汤和吴茱萸温中散寒功效的共同作用机制；北京中医药科技发展资金项目(JJ2015-56)-基于寒痛通道TRPA1的吴茱萸桂枝对宫寒小鼠的子宫容受性影响研究；北京市“3+3”李庆业名老中医工作站(2009-JC-31)；中国中医科学院自主选题项目(YZ-1316)-补肾化痰散瘀法治疗多囊卵巢综合证的机理探讨

R284.2

B

1006-3250(2017)04-0553-05

2016-10-14

△通讯作者：Michael Xi Zhu，男，教授，从事细胞信号与离子通道的研究，E-mail:Michael.x.zhu@uth.tmc.edu;杨 桢，男，教授，从事中医处方法、辛味中药的药效研究,Tel：010-64286992,E-mail：for3000yz@aliyun.com。