穴位贴敷联合穴位注射乌体林斯对OVA哮喘模型大鼠气道炎症和气道高反应的影响❋

梁志娟，耿立梅

(1. 邯郸市中心医院，河北 邯郸 056000； 2. 河北省中医院，石家庄 050011)

社会经济发展日新月异，但环境污染和人口老龄化日益凸显[1-2]，哮喘的发病率也明显升高[3-5]。现代医学认为，哮喘是以气道慢性非特异性炎症及气道的高反应性为本质的一种异质性疾病，在临床可分为急性发作期、慢性持续期和缓解期[6]。本实验使用OVA诱导Wistar大鼠发生过敏性哮喘，该模型具有高嗜酸性粒细胞浸润特征，在治疗上采用中医外治疗法，即穴位贴敷和穴位注射，这种疗法通过刺激体表穴位激发经气，调动经脉的行气血、营阴阳功能，以提高机体的免疫力防病治病，在减少哮喘反复发作方面取得了良好的疗效。在过敏性哮喘患者的气道中，Th2细胞以NF-κB依赖的方式释放IL-4、IL-5等，这些细胞因子促进B淋巴细胞合成和分泌IgE，参与气道炎症反应。另外ET-1在肺脏中含量丰富，是一种强支气管收缩剂，由上皮细胞合成95%以上的ET-1输送至黏膜下层。本实验通过建立OVA致敏的慢性持续期哮喘模型，检测其血清IgE、肺组织NF-κB及其下游细胞因子、内皮素-1水平，探讨穴位贴敷和穴位注射乌体林斯治疗哮喘的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF 级雄性Wistar大鼠，体质量(120～140)g，购于河北医科大学实验动物中心(合格证编号1605283，许可证号SCXK(冀)2013-1-003)。适应性饲养1周后随机分组为正常组、哮喘组、布地奈德雾化组、贴注组、联合组各13只。

1.2 药物、试剂及相关仪器

贴敷药物粉末(白芥子、细辛、甘遂、延胡索、百部、五味子、前胡、麻黄)由河北省中医院中药房提供，草分枝杆菌F.u.36注射液(1.72 μg/1 ml成都金星健康药业有限公司生产)，普米克令舒(1 mg、2 ml, Astrazeneca)，鸡卵清蛋白(美国Sigma公司分装，GradeⅡ)，自制透明雾化箱(60 cm×40 cm×30 cm)，NE502空气压缩式雾化器(深圳市金亿帝科技有限公司)，大鼠IgE定量ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)，IL-4、IL-5放射免疫分析药盒(北京华埠利特生物技术研究所)，碘[125I]内皮素放射免疫分析药盒(北京普尔伟业生物科技有限公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，MK3酶联免疫检测仪(芬兰雷勃)；FJ-2021 γ-放射免疫计数器(西安二六二厂)；HMIAS-2000显微图像分析系统(武汉同济医科大学)；DP73数码显微镜(Olympus)。

2 方法

2.1 模型制备

采用腹腔注射OVA致敏后加连续雾化激发制作哮喘大鼠模型，治疗期间给予间断激发模拟慢性持续期。除正常对照组外，实验第1、8天每只大鼠腹腔注射新鲜配制的10%卵蛋白1 ml(内含OVA100 mg，Al(OH)3100 mg)致敏。第16天时将造模大鼠放入不完全封闭的雾化吸入箱内开始激发，每次10只，用雾化器喷入含2%卵蛋白激发，每次20 min，每日1次，连续激发直至大鼠出现烦躁、咳嗽、呼吸加快、点头呼吸、行动迟缓、口唇紫绀甚至腹肌痉挛等症状，取血可检测到EOS升高,取肺组织HE染色观察符合炎性改变，认为哮喘模型制造成功。

2.2 给药

造模成功后开始治疗，贴注组选取大椎穴、双定喘穴、双肺俞穴、双肾俞穴，将贴敷药物使用鲜姜汁调和后进行贴敷，选取双定喘、双肺俞穴交替使用乌体林斯穴位注射(穴位注射后不再贴敷药物)，每周3次；布地奈德雾化组给予吸入用布地奈德雾化溶液雾化治疗，每日1次(药物用量参考徐叔云《药理试验方法学》[7]中人和动物用药剂量换算)；联合组采用贴敷并穴注、布地奈德雾化2种方法进行治疗,共治疗1个月共计12次。大鼠取穴参照华兴邦《大鼠穴位图谱的研制》[8]，在穴位注射之前使用10%水合氯酸腹腔注射，使大鼠处于安定状态。

2.3 标本取材

所有动物治疗完毕后，在取标本当天再次给予雾化激发，观察症状及体征并称量体质量，10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g进行腹腔注射麻醉，仰面固定于解剖台上，股动脉剪开放血3 ml/只，置于普通血清管中，随后从腹壁正中线处剪开表皮及肌肉层，剪断膈肌及两侧肋骨暴露胸腔内部器官，取右肺上叶置于冻存管中投入液氮备用检测IL-4/5和ET-1，取右肺中叶生理盐水漂洗去除血滞后放于10%甲醛溶液内固定24 h，以备制作蜡块，后期行HE染色及免疫组化染色。随即剥离左主支气管，插入灌胃针，用0.9%生理盐水分2次共注射进5 ml，行左肺肺泡灌洗，每次气道内注入回抽3次，回收液体量>70%合格，BALF液和血清皆置于低温冰箱中保存。

2.4 检测指标

使用血细胞计数板计数BALF中总的细胞数以及中性、淋巴、嗜酸分类比例；经HE染色，镜下观察肺组织病理学改变并进行炎细胞浸润评分；ELISA检测血清总IgE,放射免疫法测定肺组织中ET-1、IL-4、IL-5水平；免疫组化染色后镜下观察肺组织NF-κBp65胞核阳性表达情况，显微图像分析系统分析IOD值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 穴位贴敷联合穴位注射法对BALF中细胞总数和分类计数的影响

表1显示，模型组BALF中的细胞总数和分类计数(嗜酸、中性、淋巴)明显高于正常组(P<0.05)；各治疗组均低于哮喘组(P均<0.05)；联合组低于布地奈德组和贴注组(P均<0.05)；布地奈德组低于贴注组(P<0.05)，表明穴位贴敷和穴位注射能降低气道中炎细胞浸润，但作用不如雾化吸入激素治疗，联合使用的作用最佳。

表1 BALF中细胞总数和分类计数

注：与正常组比较:aP<0.05;与哮喘组比较:bP<0.05; 与贴注组比较:cP<0.05; 与布地奈德组比较:dP<0.05

3.2 穴位贴敷联合穴位注射对血清IgE水平的影响

表2显示，与正常组比较，哮喘组IgE水平明显增高，说明本实验制作的哮喘模型具有过敏性哮喘所具有的高IgE特点，说明模型制造成功。各个治疗组的血清IgE水平均降低(P均<0.01)，其中联合治疗组降低明显。

表2 肺组织HE炎细胞浸润评分[9]和免疫组化NF-κB阳性细胞

注：与正常组比较:aP<0.05;与哮喘组比较:bP<0.05; 与贴注组比较:cP<0.05; 与布地奈德组比较:dP<0.05

3.3 穴位贴敷联合穴位注射对肺组织中IL-4、IL-5的影响

表3显示，IL-4：哮喘组高于正常组(P<0.01),贴注组、布地奈德组、联合组低于哮喘组(P<0.05),布地奈德组低于贴注组(P<0.05)，联合组低于布地奈德组(P<0.05)。IL-5：哮喘组高于正常组(P<0.01)，贴注组、布地奈德组、联合组低于哮喘组(P<0.05),布地奈德组低于贴注组(P<0.05)，联合组低于布地奈德组(P<0.05)。

表3 肺组织中IL-4、IL-5、ET-1水平

注：与正常组比较:aP<0.05;与哮喘组比较:bP<0.05; 与贴注组比较:cP<0.05; 与布地奈德组比较:dP<0.05

3.4 肺组织ET-1水平

表3显示，哮喘组肺组织ET-1水平高于正常组(P<0.01),贴注组、布地奈德组、联合治疗组肺组织ET-1水平均低于模型组(P均<0.01)；3个治疗组之间比较，联合组、布地奈德组较贴注组降低(P<0.01,P<0.05)，联合组和布地奈德组两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.5 穴位贴敷联合穴位注射对大鼠肺组织病理学改善情况

表2显示，哮喘组肺组织病理炎细胞浸润评分比正常组显着增高(P<0.01)。3个治疗组比哮喘组降低(P均<0.01)，其中联合组改善最明显。

图1显示，正常组的支气管管腔光滑，气道及周围血管组织无明显炎性细胞浸润。哮喘组气管壁纤毛紊乱并有脱落现象，气道周围炎性细胞浸润，气道和肺泡壁增厚，可见平滑肌收缩使气道管管腔不规则。贴注组、布地奈德组、联合组支气管壁的变化、气道平滑肌受损及炎性细胞浸润程度相对较轻。

图1 各组大鼠肺组织病理比较(HE×400)注：正常组、哮喘组、贴注组、布地奈德雾化组、联合组

3.6 穴位贴敷联合穴位注射对肺组织NF-κBp65阳性细胞IOD表达及免疫组化NF-κBp65入核情况影响

表2显示，哮喘组大鼠肺组织NF-κBp65阳性细胞IOD值高于正常组(P<0.01)，贴注组、布地奈德组、联合组均低于模型组(P均<0.01)；联合组肺组织NF-κBp65阳性细胞IOD值较贴注组、布地奈德组低(P<0.01)，布地奈德组低于贴注组(P<0.01)。

图2显示，细胞核染成黄色、棕黄色、棕色的细胞为NF-κBp65阳性细胞，表明NF-κB从胞浆进入胞核活化，可见正常组气道上皮细胞有个别胞核阳性细胞，哮喘组胞核阳性细胞明显可见，各治疗组胞核阳性细胞减少，治疗组中联合组胞核阳性细胞最少。

图2 NF-κB在气道中的表达比较(免疫组化×400)注：正常组、哮喘组、贴注组、布地奈德雾化组、联合组

4 讨论

哮喘的慢性气道炎症是其基本特征之一，其中Th1/Th2失衡已被认为是哮喘发生的重要机制。在此过程中，Th2细胞通过分泌多种细胞因子参与致病，这些细胞因子进一步促进B淋巴细胞合成和分泌IgE，并与多种炎性细胞上的受体结合，参与炎症反应，因此IgE升高是过敏性哮喘气道炎症的核心。而且多项研究提示，抗IgE治疗药物奥马珠单抗在改善患者症状、减少急发事件和激素用量上取得很好成绩[10-11]。另外，过敏性哮喘是发生在气道的嗜酸性细胞聚集的典型过敏性疾病，EOS增多主要通过IL-5依赖和非IL-5依赖两种机制，其中IL-4是非IL-5依赖机制中重要的炎症因子之一。有研究显示，阻断IL-5后能够使外周血和痰液中EOS浸润减少[12-13]。在上述气道的IgE增多和EOS浸润导致过敏性哮喘发生机制的上游，是Th2细胞依赖NF-κB释放细胞因子和炎性介质。哮喘患者NF-κB核定位、IκB(κB抑制蛋白)的磷酸化及IKK-β(κB激酶)在气道中的表达量均增高[14]。正常情况下，NF-κB与其抑制蛋白以无活性的形式存在于细胞浆中，遇刺激后进入细胞核活化，调节基因转录。NF-κB调控Thl/Th2细胞因子相关基因表达的结果是使炎症因子产生级联放大，对机体免疫或炎症反应的启动及维持发挥重要作用。气道高反应性是哮喘的另一个典型特征，肺是ET-1含量最丰富的器官，由上皮细胞合成的ET-1，95%以上输送至黏膜下层。有研究提示，ET-1的特异性结合位点在气道平滑肌最致密，ET-1也是强支气管收缩剂，吸入ET-1后支气管收缩效能大约是乙酰胆碱的100倍，所以ET-1是一种较强的支气管平滑肌收缩剂[15]。

本研究表明，OVA诱导哮喘大鼠模型血清IgE、肺组织NF-κB及其下游细胞因子IL-4、IL-5、肺组织ET-1水平较正常组显着增高，病理图片及评分显示炎症改变明显。经过干预后，治疗组的各项指标较模型组均有降低，3治疗组之间比较联合治疗组治疗效果最明显，贴注组和布地奈德雾化组两者比较，布地奈德治疗组效果明显。但联合组和布地奈德组两者之间比较，ET-1水平差异无统计学意义，造成这种原因不排除存在穴位贴敷操作技术上的原因。总之，经过穴位贴敷和注射乌体林斯能够改善气道炎症，其作用机制可能为抑制肺组织中NF-κB从胞浆进入胞核后的活化，从而降低其下游细胞因子IL-4、IL-5水平，进而阻断这些下游细胞因子，促进B淋巴细胞产生IgE引起的炎症反应；另外，穴位贴敷联合穴位注射乌体林斯能够降低气道高反应性，其作用机制可能与抑制气道上皮细胞产生过量的ET-1有关。