基于网络药理学的骨碎补“疗伤止痛，补肾强骨”作用机制初探

陈国铭，汤顺莉，黄 雁，於菁雯，邝梓君，林洪荣，赵金龙，刘韵韵， 张培婵，陈子茵，江晓兵

(1. 广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405； 2. 广州中医药大学第三临床医学院， 广州 510405； 3. 广州中医药大学针灸康复临床医学院，广州 510405； 4. 广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)

骨碎补为骨科常用中药，是水龙骨科(Polypodiaceae)多年生蕨类植物槲蕨Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm.的干燥根茎，始载于《药性论》，味苦、性温，归肝、肾经，具有疗伤止痛、补肾强骨之功效，主治跌仆闪挫、筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨痿软、耳鸣耳聋、牙齿松动，外用消风祛斑，可治疗斑秃、白癜风等[1]。现代药理表明，骨碎补具有良好的促进骨折愈合、抗骨质疏松、抗炎、促进牙齿生长、防治中毒性耳聋、降血脂等活性。中药是一个复杂的化学成分体系，其中活性成分通过多靶点、多途径、多层次的整合调控产生协同功效[2]。因中药成分复杂，数量庞大，难以深入研究，但中药网络药理学则为此提供了新的思路和视角[3]。网络药理学基于“化合物-靶点-疾病”相互作用网络研究药物，其研究策略的整体性、系统性特点与中医学的整体观念和辨证论治理论不谋而合。因此本课题基于网络药理学研究“骨碎补”，以期明确骨碎补中医疗效的作用机制，并进一步深入挖掘骨碎补的其他临床应用。

1 方法

1.1 骨碎补化合物分子库的构建

以中药“骨碎补”为主题词，从中药系统药理学分析平台(TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)中检索出骨碎补所有化学成分共142个。考虑到筛选条件应为决定药物口服利用度以及成药性优劣的关键参数，故采纳TCMSP推荐的预测策略，将口服利用度(OB)≥50%和类药性(DL)≥0.18设定为筛选条件,将数据库中具有较高活性的化合物筛选出来,最终得到符合条件的化合物共7个。

1.2 化合物-靶标-疾病的药理学网络构建

在TCMSP上全面检索与7个活性化合物相关的潜在靶标，利用Cytoscape 3.5.1软件将7个候选化合物与其潜在靶标构建成一个体现候选化合物-靶点相互作用的复杂网络图，并根据得出的潜在靶点在TCMSP中检索出相关的疾病，进而可绘制靶点-疾病相互作用复杂网络图。

2 结果

2.1 活性化合物筛选结果

图1 活性化合物结构式

表1图1显示，通过数据库检索共收集到骨碎补成分化合物142个，设定OB≥50%和DL≥0.18进行筛选，最终得到7个匹配的活性化合物，其中4个黄酮类化合物，2个苷类化合物，1个酯类化合物。筛选出的化合物均同时具有较高的OB和DL值，如MOL005190(OB=71.79%，DL=0.24)、MOL009078(OB=62.65%，DL=0.51)，目前已有不少文献报道黄酮类化合物治疗骨质疏松症确有一定疗效，如其中柚皮素通过调控CTSK、Wnt/β-catenin 等信号通路发挥作用[4-5]。OB、DL和degree值排名第一的3个活性分子分别为eriodictyol(圣草苷)、davallioside A_qt(骨碎补苷A_qt)和naringenin(柚皮素)。

表1 通过OB-DL值预测筛选出骨碎补有效成分信息

2.2 有效化合物—潜在靶标的作用网络分析

本研究中，笔者将经过 OB 和 DL 筛选的 7个活性化合物及其潜在的靶标相连来构建分子-靶点相互作用网络。活性化合物-潜在靶标相互作用网络包含62个节点(6 个化合物和 56个潜在靶标) 和 73条边，另化合物MOL009087(marioside_qt)因在数据处理过程中发现，其在该数据库中还未有相关的靶点，故而在构建候选化合物-潜在靶标网络中，只显示相关的6个化合物。在网络图中，红色节点代表候选化合物，黄色和灰色节点表示药物靶标，而每条边则表示候选化合物分子与靶标间的相互作用关系。在网络中，一个节点(node)的度值(degree)表示网络中和节点相连的路线条数，每一个化合物的度值即表示候选化合物分子所拥有的靶点数目; 而每一个靶点的度值则代表着相应靶点所有相关活性化合物分子的数目。

图2显示，通过对分子-靶点相互作用复杂网络节点的度值进行统计和排列，将网络图重构成分子-靶点排序网络图，并使用分层染色使其一目了然。通过排序网络图可以发现，参与网络构建的化合物作用的不同通路以及频次高低，通过分析通路和频次，可以估测和评价候选化合物在药物起效机制中的作用。图中各节点面积大小与其度值成正比，面积越大表明其能作用于更多的其他节点。黄色节点代表能够被2个或2个以上骨碎补活性化合物作用的人体靶点，灰色节点代表只被一个骨碎补活性成分作用的孤立靶点。

图2 骨碎补活性化合物与其靶标相互作用网络

图2显示，面积最大的节点是骨碎补活性分子MOL004328(naringenin)，拥有最多的潜在靶标(37 个)，其次是MOL000492((+)-catechin)，有11个潜在靶标，MOL001978(Aureusidin)有9个潜在靶标。这些度值高的药物分子有可能在骨碎补药理功能中发挥较为重要的作用。在56个潜在靶标中，有9个靶标至少与2个化合物分子连接。图2显示，红色节点正是通过这9个靶标(黄色节点)间接相连，提示中药各成分之间很可能是通过此种方式起协同作用。有47个靶标只与 1 个候选化合物分子相关。利用Cytoscape自带的强大网络分析工具(Network Analyzer)对骨碎补活性化合物-靶标相互作用网络进行无向性(Undirected)拓扑学分析表明，网络中每个候选化合物都至少与3个潜在靶标连接，网络的中介中心度为0.587，共有3787条最短通路，典型通路长度2.952，平均度值2.355，网络异质性2.058，说明骨碎补中含有的候选化合物分子可能作用于整个生物网络系统，而不单一作用于某一个潜在靶标，从而更进一步说明中草药作用的整体性与复杂性。在7个化合物中，度值最高为naringenin即柚皮素(37)，其为黄酮类化合物，具有抗骨质疏松作用，可通过影响破骨相关基因表达抑制破骨细胞成熟和分化[6]。OB 值最高的为eriodictyol即圣草酚(OB=71.79%)，其为黄酮类成分，具有较强的抗氧化、抗炎、镇痛、改善糖尿病及糖尿病并发症的作用[7]，主要通过CTSK、Wnt/β-catenin 等信号通道起效。DL 最高的davallioside A_qt 即骨碎补苷A(DL=0.51)，但目前关于此化合物的研究甚少，为以后的研究提供了方向。现将这3个化学成分具体介绍如下。

2.2.1 柚皮素(Naringenin) 柚皮素作为柚皮苷的主要代谢产物，是一种广泛存在于芸香科植物中的二氢黄酮类化合物。国内外药理研究表明，柚皮素具有抗菌消炎、抗氧化、抗癌抗肿瘤、抗损伤、降血脂等多种药理活性[8]。以往骨碎补活性单体成分调控骨质疏松实验的干预措施多为柚皮苷，但近年来不少动物实验研究结果表明，柚皮素同样具有明显的抗骨质疏松作用。如宋双红[9]、翟远坤等[10]的研究表明，柚皮素具有明显的促骨形成活性，能够促进成骨相关基因表达，保持骨密度。更有Pang，W Y等[11]体外实验进一步探究表明，柚皮素对成骨细胞促骨形成活性要优于柚皮苷。吴新涛等[12]研究发现，柚皮素可能通过上调 Bcl-2 表达、下调 Bax、 Caspase-3 表达等机制对氧化应激诱导的成骨细胞凋亡具有拮抗作用，同时柚皮素通过影响破骨细胞特异性基因TRAP、MMP-9、CATK、OPG/RANKL/RANK的表达，能够明显抑制破骨细胞分化和成熟，促使骨组织向成骨方向发展，这揭示了柚皮素作用于骨质疏松症的可能机制。

2.2.2 圣草苷(eriodictyol) 圣草苷是骨碎补中另一个主要的黄酮类活性成分。作为自由基受体及链终止剂的黄酮类化合物具有抗氧化活性，其抗氧化能力大小与羟基位置及羟化程度有重要关系。抗氧化活性最强的是B环上有邻二酚羟基的黄酮[13]。由圣草苷的结构式(见图1)可知，圣草苷正是B环上具有邻二酚羟基的黄酮，据此可以推测圣草苷是一种潜在的抗氧化活性很强的天然抗氧化剂。目前研究表明，圣草酚具有抗炎、抗氧化、镇痛、改善糖尿病及糖尿病并发症的作用[7]。Song，F等[14]观察到，Eriodictyol能够通过抑制NFATc1活性和RANKL诱导NF-kB、MAPK、Ca2+信号通路来阻止RANKL诱导破骨细胞的形成。Li、L等[15]通过RT-PCR发现，圣草苷可以上调成骨分化过程中Runx2、COLI和BGP 3个标志性基因的表达，此外圣草苷还可在一定程度上逆转PD98059对细胞分化的抑制，起到抗骨质疏松的作用。因此，圣草苷防治骨质疏松症和其他骨相关疾病的应用前景广阔。

2.2.3 骨碎补苷A_qt(davallioside A_qt) 目前对该化合物的研究较少，本研究通过分析化合物-靶点-疾病网络发现其较多的作用于凝血因子，与多种心血管疾病相关，可以作为未来实验探究的一个方向。

2.3 潜在靶标—相关疾病的作用网络分析

图3为根据潜在靶标与相关疾病构建而成的网络图。该网络图中有56个靶标和131种相关疾病共187个节点(红色为靶点，白色为相关疾病)，节点大小与其自身度值成正比。在TCMSP上发现，活性化合物所涉及的靶点数目有 56个，而在靶标-疾病网络中只显示34个相应靶点蛋白，由此可知，有22个靶标在网络中没有相对应的疾病，由此可推测骨碎补可能还存在尚未被发现的临床应用价值，提示可为之后全面挖掘骨碎补临床应用提供突破方向，发现其可用于治疗的更多疾病。表2为潜在靶标对应相关疾病和骨碎补成分的度值，可以看出一个靶蛋白可以与许多疾病相关。靶标与疾病度值前三位依次为前列腺素G/H合酶2、DNA拓扑异构酶II、热休克蛋白HSP 90。前列腺素G/H合酶2也称环氧合酶(COX-2)，是前列腺素类物质合成的关键酶，它在动脉粥样硬化、血管成形术后狭窄等血管炎性疾病的发展中扮演着重要角色[16]。前列腺素G / H合酶2的潜在靶标度值最高为39，可见其治疗疾病范围最为广阔，提示可能为骨碎补药效机制的主要靶标。李洋[17]等研究表明，BMP9在诱导干细胞成骨分化过程中激活PI3K/Akt信号，可能与其促进COX-2表达有关,且COX-2抑制剂具有明显延迟骨折愈合的不良反应。COX2的表达水平以及其引起的PG分泌，会影响软骨细胞形成和软骨内化骨，从而促进成骨细胞活性和骨形成。度值为22的DNA拓扑异构酶IIα，是DNA代谢过程中重要核酶，目前已成为许多抗癌药物的作用靶点。热休克蛋白HSP90是在生物体中广泛存在的一种保守蛋白，其在生物体受到外界胁迫时起到分子伴侣作用，现代研究验证，其具有延长细胞寿命、抑制细胞凋亡的作用。郭晓华等[18]研究发现，HSP90与eNOS 结合增加NO合成释放，可舒张血管，改善肾缺血，另外还有参与肿瘤免疫[19]、调控肿瘤生长和转移的作用[20]。Siebelt，M等[21]研究表明，软骨细胞应激诱导的Hsp90合成在骨关节炎(OA)发病中起重要作用。剧烈运动引起的生物力学应力往往会增加大鼠关节软骨中的Hsp90蛋白水平。Hsp90抑制和随后增加的Hsp70水平，使软骨细胞通过将糖胺聚糖(sGAG)量增加到基线以上来维持软骨体内平衡，保护细胞外基质在身体活动期间增加生物力学影响。Hsp90抑制进一步改善软骨下骨厚度并减少滑膜巨噬细胞活化，说明HSP90抑制可潜在地保护或改善软骨健康，并可能阻止OA的发展。HSP的缺失也可导致神经退行性疾病[22]。此外，高度值的靶标还有前列腺素G/H合酶1、Calmodulin、Coagulation factor Xa等，涉及的通路与疾病十分广泛，由此可知潜在靶标可作用于机体各个系统，包括心血管、内分泌、神经、生殖等系统，通过查阅相关现代药理学研究文献可充分验证该观点。

图3 骨碎补活性化合物靶标与相关疾病相互作用网络

序号与化合物度值(degree)潜在靶标(Target)名称与疾病度值(degree)15Prostaglandin G/H synthase 2(前列腺素G / H合酶2)3921DNA topoisomerase II(DNA拓扑异构酶II)2235Heat shock protein HSP 90(热休克蛋白HSP 90)2243Prostaglandin G/H synthase 12051Calmodulin1761Coagulation factor Xa1673mRNA of PKA Catalytic Subunit C-al-pha1482Nuclear receptor coactivator 21493Estrogen receptor10102Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit, gamma iso-form8111Nitric oxide synthase, inducible7121Androgen receptor6131Caspase-36142Beta-lactamase5151Retinoic acid receptor RXR-alpha5162Peroxisome proliferator activated re-ceptor gamma4171Glycogen synthase kinase-3 beta4181RAC-alpha serine/threonine-protein kinase4191Apoptosis regulator Bcl-24201Carbonic anhydrase II3211Estrogen receptor beta3221Mitogen-activated protein kinase 143231Transcription factor p653241Glutathione S-transferase P3251Hyaluronan synthase 23261Heme oxygenase 13

表3 潜在标靶相关疾病(degree≥3)出现频次比较

3 讨论

历代文献对骨碎补均有记载，如《药性论》：“主骨中毒气，风血疼痛，五劳六极，口手不收，上热下冷。”《本草图经》：“治闪折筋骨损伤”“又用治耳聋”“亦入妇人血气药用”。《本草纲目》：“治耳鸣及肾虚久泄、牙痛。”由此可见，中医对药物治疗疾病的认识具有整体观，而基于大数据“多成分-多靶点”的网络药理学正好打破了以往药理学研究单一成分单一靶标的缺点，是从整体认识和探究中药复杂成分治病机制的有力手段[23]。

现代《药典》认为，骨碎补具有“疗伤止痛、补肾强骨”的功效。本次研究从骨碎补142个成分中筛选出7个具有高口服利用度和高类药性的活性成分，相应的有56个靶点和131种疾病，揭示了中医“异病同治”的物质基础。研究表明，度值最高的成分柚皮素具有促进骨细胞形成、抗骨质疏松的作用，口服利用度最高的成分圣草酚具有抗炎、抗骨质疏松的作用，这与中医所讲“止痛、强骨”有密切联系。其重要靶标亦被证实，与调节骨代谢和抗氧化相关，主要涉及癌症、炎症性疾病、神经退行性病变、骨质疏松、阿尔茨海默症、脑损伤等疾病。中医认为“肾主骨、骨生髓、脑为髓之海”，因此骨碎补“补肾”的功效可能与治疗上述疾病相关。另外，从网络中也能够发现一些尚待深入研究的方向。

综上所述，在大数据急速发展的生物信息时代，运用网络药理学研究中药符合中医所提倡的“整体观”，该方法具有很大的潜力，值得探索。其研究结果具有一定的参考价值和提示作用，若要进一步运用于指导临床，则需相关基础和临床实验进行验证。