杨 寰，杜金城，杜钢军
(1. 开封市中医院药剂科，河南 开封 475001； 2. 湖南中医药大学，长沙 410208；3. 河南大学药学院，河南 开封 475004)
皮肤肿瘤是发生于身体暴露部位恶性肿瘤的统称，系表皮角质形成细胞恶性增生的结果[1]，产生的病因目前尚不清楚。左金丸源于《丹溪心法》，由黄连和吴茱萸按6∶1组成，有清肝泻火、降逆止呕的功效[2]。现代药理研究表明，其对胃癌、乳腺癌、大肠癌等均有防治作用[3-5]，但对皮肤肿瘤是否具有防治作用尚未有报道。动物模型是肿瘤相关研究的重要工具，本研究采用与人体皮肤肿瘤发病机制相似的DMBA/TPA二阶段小鼠皮肤肿瘤模型，观察左金丸对皮肤癌的预防作用，为左金丸防治皮肤肿瘤提供实验依据。
1 材料
1.1 实验动物
昆明雌性小鼠，体质量20～24 g，购于河南省医学实验动物中心 (动物生产许可证SCXK(豫)2015-0002)。
1.2 药品及试剂
左金丸按原方中所含中药黄连和吴茱萸6∶1的比例称取中药配方颗粒(黄连、吴茱萸均购开封天济堂大药房，由开封市中医院药剂科中药室杨寰主管药师鉴定为正品，并制备为配方颗粒。配方颗粒剂中黄连、吴茱萸颗粒剂为 1 g相当于饮片5 g)组成，用时按需要用生理盐水溶成所需溶液。二甲基苯蒽(批号160839)、巴豆油(批号160218)、多聚甲醛(批号160423)和苏木精(批号150622)购自美国 sigma 公司；PCNA、E-cadherin、N-cadherin、HRP-羊抗兔二抗(批号20160908)购自武汉三鹰生物技术有限公司；IL-1、IL-6、hs-CRP、TNF-α和AEC试剂盒(批号20160912)，购自美国安迪生物技术有限公司；AST、ALT和肌酐试剂盒(批号20160815)，购自南京建成生物工程研究所；免疫组化试剂盒(批号20160910)，购自武汉博士德生物工程有限公司，其余试剂均为市售分析纯。
1.3 实验器材
FA1004 N型电子天平，上海精密仪器有限公司；YLA-1 A型多功能小鼠自主活动仪，淮北正华生物仪器设备有限公司；XFA6130全自动动物血液细胞分析仪，南京普朗医疗设备有限公司；ELX-800UV型酶标仪，美国Bio-Tek公司；RM2235型转轮式切片机，德国莱卡公司；BX43病理图像分析系统，日本奥林巴斯公司。
2 方法
2.1 皮肤肿瘤模型建立与分组
昆明雌鼠用蒸馏水将背部的皮肤润湿(2×2 cm 左右的面积)，取脱毛膏适量均匀涂抹在小鼠背部。5 min 之后，观察到背毛已溶解时，轻轻用温水擦掉残留的脱毛膏和已溶解的背毛，然后用干毛巾将小鼠背部脱毛处擦干。将背部脱毛小鼠75只按随机数字表法分为正常组、模型组和左金丸组，每组小鼠各25只。分组次日，模型组和左金丸组用75 mg/100 ml 的二甲基苯蒽丙酮液0.2 ml涂于小鼠背部脱毛处，每周1次，连涂3周。从第4 周开始，在小鼠背部二甲基苯蒽诱瘤部位涂0.25 ml/100 ml 的巴豆油丙酮液0.2 ml，每周 2 次，直到皮肤乳状肉瘤数目保持2周不再增加，停止涂抹巴豆油，终结实验。正常组与模型组平行仅涂相同容量的丙酮。
2.2 药物预防
小鼠第1次涂二甲基苯蒽丙酮液后次日，左金丸组按人体等效剂量原药材0.75 g/kg体质量将配方颗粒溶成0.75%的溶液，以0.2 ml/10 g体质量给小鼠灌胃，每日2次，每周给药6 d。正常组和模型组平行灌胃等容量生理盐水。
2.3 常规指标检测
每日观察小鼠活动、毛色是否正常，如有死亡解剖检查原因。实验结束前1周记录饮食量，计算平均每只小鼠的周饮食量；实验结束前2 d自主活动仪检测自主活动，计算平均每只小鼠10 min内的活动次数；实验结束后小鼠眼眶静脉丛采血，血液细胞分析仪自动完成红细胞、白细胞和血小板计数，并自动计算血红蛋白含量，其中白细胞计数包含占白细胞比例较多的淋巴细胞和中性粒细胞计数；部分血清用试剂盒检测AST、ALT和肌酐含量。
2.4 肿瘤相关指标检测
记录小鼠皮肤乳状肉瘤肉眼可见出现时间及每只小鼠每周的皮肤乳状肉瘤数目，待皮肤乳状肉瘤数目稳定2周后终结实验。各组小鼠计数皮肤乳状肉瘤数目后眼眶静脉采血分离血清，按试剂盒说明检测IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α含量。之后处死小鼠，取皮肤致瘤组织做免疫组化染色，分析皮肤组织中E-Cadherin、N-Cadherin和增殖标志PCNA表达强度，评价左金丸对小鼠皮肤肿瘤的预防效果。
免疫组化过程与评价方法如下： 将皮肤致瘤组织0.38%的多聚甲醛PBS中性溶液固定48 h后常规酒精梯度脱水、石蜡包埋，切成4 μm后的切片后贴附于防脱载玻片上，经常规脱蜡和水化后于3%H2O2溶液中室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性;将切片放入柠檬酸缓冲液微波煮沸5 min×2次修复抗原;5%BSA 室温封闭20 min，倾去多余液体，滴加1∶50 稀释的E-Cadherin、N-Cadherin和PCNA兔抗鼠多克隆抗体，4 ℃过夜;PBS洗3次后生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min;PBS冲洗3次后滴加 SABC，37 ℃ 孵育 20 min;PBS冲洗3次后AEC显色剂显色，苏木素轻度复染核，封片后在光镜下观察。采用半定量方法表达结果，切片的染色强度记分:0分：染色为阴性;1分：染色为弱阳性(浅红棕色);2分：染色为阳性(红棕色); 3分：染色为强阳性(深红棕色)。
2.5 统计学方法
3 结果
3.1 左金丸对小鼠常规指标的影响
表1显示，与正常小鼠比较，模型组和左金丸组小鼠食量和自主活动均有减少趋势(P>0.05)，白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数均明显升高(P<0.05)，但模型组和左金丸组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。对其他代表肝功能的血清AST和ALT含量(P>0.05)，代表肾功能的血清肌酐含量(P>0.05)，代表血液毒性的血红蛋白含量(P>0.05)、红细胞和血小板数(P>0.05)进行常规指标检测，正常组小鼠、模型组和左金丸组小鼠组间比较差异无统计学意义。
表1 左金丸对小鼠常规指标的影响
注：与模型组比较：*P<0.05
3.2 左金丸对小鼠皮肤肿瘤相关指标的影响
表2显示，模型组和左金丸组小鼠到实验终结时外观和活动均无异常的小鼠有20只，模型组小鼠成瘤时间始于诱癌后第6周，第10周后肿瘤数量不再增加，20只小鼠全部出现皮肤肿瘤；左金丸组小鼠成瘤时间始于诱瘤后第8周, 第10周后肿瘤数量不再增加，20只小鼠中14只出现皮肤肿瘤，肿瘤发生率和平均每只小鼠致瘤数与模型组比较均有显着减少(P<0.01)。与正常小鼠比较，模型组小鼠血清IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α炎症因子均明显增高(P<0.01)；与模型组比较，左金丸对上述血清炎症因子均有显着降低作用(P<0.01)。
表2 左金丸对小鼠皮肤肿瘤相关指标的影响
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01
表2图1显示，与正常组小鼠比较，模型组小鼠皮肤组织E-Cadherin明显降低、N-Cadherin明显升高，上皮-间充质转化增强(P<0.01)，增殖标志物PCNA明显升高(P<0.01)。与模型组比较，左金丸对皮肤组织上皮-间充质转化和增殖均有显着降低作用(P<0.05)。
图1 左金丸对小鼠皮肤组织上皮-间充质转化和增殖的影响(免疫组化 ×200)
4 讨论
皮肤肿瘤可能的因素有紫外光照射、长期不愈的慢性溃疡、烧伤瘢痕等，一旦发生可向内脏转移致死，目前尚无十分有效的治疗药物[6]。中药具有未病先防的优势，很明显不论从花费还是从疗效上都要优于发病后的治疗。左金丸仅由黄连和吴茱萸2味药组成，方中黄连苦寒、清热燥湿、泻火解毒，吴茱萸辛苦且热、辛散温通、温肝暖肾，两药寒热配对，共奏清泻肝火、降逆和胃、开郁散结之功。中医学认为,皮肤肿瘤是内有痰浊、外有火毒、风毒相搏、气滞血瘀等致病因素引起[7]。本研究结果表明，左金丸按人体等效剂量给药对二甲基苯蒽/巴豆油诱导小鼠皮肤肿瘤不仅减少肿瘤数目，也降低致肿瘤小鼠数量，为其用于防治皮肤肿瘤提供了实验依据，也符合中药重视清除毒邪、消除肿瘤因毒而生病因的防治原则[8]。
目前研究显示，黄连-吴茱萸药对主要功效物质基础为生物碱类成分，黄连中的黄连素和吴茱萸的吴茱萸碱对多种肿瘤细胞有直接生长抑制作用[9-10]，应该是左金丸防治肿瘤的物质基础。龚梦鹃等对左金丸血清药物化学进行初步研究，口服左金丸水煎液后在大鼠血清中发现14个入血成分，其中5个为原型成分，9个为代谢产物[11]。肿瘤发生不论外因主导还是内源性机制，致病因素持续存在引起的持续性炎症损伤和修复决定了肿瘤以 “慢性炎症”为特征的病理特点[12]。本研究结果表明，左金丸对皮肤肿瘤小鼠血清IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α炎症因子均有显着降低作用，体现了左金丸改善机体炎性微环境预防皮肤肿瘤的中医整体观，也隐含了皮肤肿瘤像其他肿瘤一样的系统炎症发病机制。
虽然肿瘤发生的机制尚不清楚，但皮肤组织上皮-间充质转化和增殖是肿瘤发生的基础[13]。本研究结果表明，左金丸对皮肤组织上皮-间充质转化和增殖均有显着降低作用。结合左金丸不引起传统化疗药物一样的系统毒性，从安全性和经济成本上均比肿瘤化学防治药有明显优势，加之其既能使肝火清而自不横逆犯胃、使胃火清的同时清降胃气，体现了中药治病“祛邪不忘保胃气、调养之中护胃气”的肿瘤防治思想[14]，有望成为一个防治肿瘤的物美价廉良药。
