杨湘蕃， 张华敏， 唐丹丽， 李 想， 李盈盈， 吴浩南， 刘思鸿△

(1.云南中医药大学， 昆明 650500；2.中国中医科学院中药研究所， 北京 100700；3.中国中医科学院医学实验中心， 北京 100700；4.中国中医科学院中医药信息研究所， 北京 100700)

目前，中药处方优化方法多为撤药和拆方，即将大处方拆分为多个小组合，随后开展多次实验对比其疗效，这需要经过数十次甚至数百次的实验，花费大量的时间和精力，故亟需寻找一种新的处方优化方法。课题组前期研发了一种基于中医“君臣佐使”理论的加权网络模块划分优化方法[1]，其以群体协同为核心开展网络模块划分，同时参照中医君臣佐使理论对药理网络进行加权处理，并提出了一种寻找网络核心节点的方法。借助网络的双向性，可以从核心节点反推出核心药物，从而实现处方优化。

痰瘀同治方是课题组依据痰瘀同治法提出的临床有效方，包含赤芍、瓜蒌等药物。临床实践证明，痰瘀同治方是治疗冠心病的有效方剂，具有活血化痰、通阳宣痹之效[2]。痰瘀同治方也是治疗心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MI/RI)的有效中药复方。前期研究证实，该方可通过降低炎症因子、抑制自噬与凋亡和调节血脂代谢异常等多途径起到保护心肌、改善MI/RI的作用[2-7]。但本方包含13味中药，药味繁多、成分复杂，难以清晰阐明其药效物质基础和作用机制。因此，本文将采用基于中医“君臣佐使”理论的加权网络模块划分优化方法对其进行优化，并通过对比心梗面积、心肌酶谱、氧化应激、炎症因子等指标观察优化后的方剂与原方对MI/RI的作用，验证该优化方法的有效性与可行性，为中药复方优化提供新思路和新方法。本研究通过中国中医科学院医学实验中心实验动物伦理委员会审查。

1 材料与方法

1.1 痰瘀同治方抗MI/RI“成分-靶点-疾病”的加权药理网络构建

利用公开的中药成分、靶点和疾病靶点等各类组学数据库，构建痰瘀同治方抗MI/RI的“成分-靶点-疾病”药理网络，在此基础上根据君臣佐使理论对网络的边赋予权重(详见前期研究)[1]。

1.2 以群体协同算法为核心的网络模块划分方法

采用群体协同算法，以群体协同模块度为目标，进行模块识别和划分，利用节点度中心性(degree centrality，DC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和自定义的加权接近中心性(weighted closeness centrality，WCC)寻找核心成分群(详见前期研究)[1]。

1.3 药物与动物

痰瘀同治方基础方组成：药物1～13。优化方1组成：药物1～6。优化方2组成：药物1～5，9，11(优化方1和优化方2优化过程详见后文)。中药材购于北京同仁堂饮片有限责任公司，并由其出具药材产地及品质鉴定证明。

SPF级雄性SD大鼠80只，体质量(200±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK-(京)2016-0006。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房，自由摄取灭菌水及普通饲料，饲养环境为温度(22±1)℃，湿度(55±5)%。

1.4 主要试剂与仪器

肌酸激酶(creatine kinase, CK，批号201041)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB，批号201011)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH，批号200801)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST，批号200801)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT，批号200951)检测试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)Elisa检测试剂盒(武汉华美生物工程有限公司,批号Y19035697)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒、BCA法蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号010620200831，042820200913)；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α，批号218247-009)、白细胞介素(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6(Elisa检测试剂盒，赛默飞世尔科技中国有限公司，批号226593-006，219558-006)。

SynrgyH1型多功能酶标仪，美国BioTek；Mikro 200 R型高速离心机，德国Hettich；日立7180型全自动生化分析仪，日本HITACHI；Precellys Evolution生物样品均质混匀系统，法国Bertin Technologies；ALC-V8型动物呼吸机，上海奥尔科特公司；RM6240系列多道生理信号采集处理系统，成都仪器厂。

1.5 分组与给药

将80只SD大鼠按随机数表法分为假手术组、MI/RI模型组、基础方组、优化方1组及优化方2组共5组各16只。各组药物剂量按60 kg成人每日1剂原方用量换算出大鼠每日用量，分别浓缩成含生药量1.2 g/mL、0.6 g/mL及0.76 g/mL的水煎液[8]，按14 g/(kg·d)、7.5 g/(kg·d)、9.42 g/(kg·d)的剂量灌胃给药，每日1次，连续给药3周。假手术组、MI/RI模型组大鼠按10 mL/kg灌服去离子水。

1.6 模型复制

动物模型的复制采用课题组前期造模方法[9]，大鼠用20%乌拉坦全身麻醉并仰卧位固定，四肢皮下插入电极并连接RM6240系列多道生理信号采集处理系统并记录心电图。大鼠颈部和左胸手术备皮并将气管接入呼吸机(呼吸频率80次/min，吸呼比1∶2，潮气量8 mL/kg)，观察大鼠呼吸状态是否正常。胸骨左侧第3～4肋间逐层打开胸腔，并用弯镊撕开心包膜使心脏充分暴露，用6-0号缝合线在左心耳下2 mm处结扎，用粗棉线垫底结扎冠状动脉左前降支30 min，后松开缝合线取出棉线再灌注2 h。造模成功标准为缺血时局部心肌壁发绀、膨出，心电图ST段明显抬高或T波高耸。

1.7 标本采集

模型复制结束后，打开腹腔，腹主动脉采血，-80 ℃留存血清。心脏灌流后剪取心脏，-80 ℃备用。

1.8 指标检测

根据各指标试剂盒说明书用全自动生化分析仪检测大鼠血清AST、ALT、LDH、CK及CK-MB含量，或采用Elisa法检测cTnI、IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.8.1 心肌组织中MDA含量检测 按照MDA检测试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒说明书的操作步骤进行实验，在450 nm波长处用酶标仪测定光密度值，根据标准曲线计算后得出MDA含量。

1.8.2 心肌梗死面积检测 取全心冷冻20 min后，沿冠状位由前向后切片，厚度约为2 mm，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色，观察心肌梗死情况，其中灰白色为梗死区，深红色为非梗死区，最后用Image J图像分析系统处理并计算心肌梗死面积比[10]。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 痰瘀同治方处方优化结果

利用以群体协同为核心的模块划分方法，在加权网络中共得到13个群体协同模块[11]，排除模块度在0.3以下和模块中节点数目过少(<3)的模块，共纳入10个模块进行分析。图1、2示，统计所有模块中每个中药的DC和CC值，发现DC值和CC值基本上分布比较平均，仅药物9在模块9里出现1个较大的DC值，提示药物9或许在特定领域中对MI/RI起作用。

图1 群体协同模块中的DC值

图2 群体协同模块中的CC值

在加权网络中，由于权重系数及拓扑结构的原因，单纯用经过边的数量难以反映2个点之间联系的密切程度，于是提出用WCC从加权网络的角度来判断药物的中心度，具体算法见前文[11]，WCC值越大说明节点在模块中的重要性越高。图3示，统计每个中药在所有模块中的WCC值，发现药物1、药物2、药物3的值较大。然后在模块度排名前5的5个模块中，取WCC排名前3位的药物得到核心药物组合(药物1～6)。同时也发现，这几种药物的DC值和CC值在模块中排名靠前，说明这几味药物在网络中处于核心地位。

图3 群体协同模块中的WCC值

另一方面，对每个模块进行分析后发现，药物6几乎在所有的模块都有出现，回溯发现或许是因为药物6的成分个数过多，约占总成分个数的20%(103/504)，考虑是否排除药物6进行验证。同时，观察到特殊的模块7，其成分个数大于等于3的药物仅有药物6、药物9、药物11，且药物9在模块9里出现1个非常大的DC值，提示药物9和药物11或许在特定领域中对MI/RI起作用。

因此，综合考虑并拟定出优化方1(药物1～6)和优化方2(药物1～5,9,11)进行下一步实验验证。

2.2 优化方1、优化方2与原方药效学比较研究

2.2.1 各组大鼠血清LDH、CK、CK-MB和cTnI表达 表1示，与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠血清LDH、CK、CK-MB和cTnI的含量显着升高(P<0.01)；与MI/RI模型组比较，基础方组和优化方1组血清LDH、CK、CK-MB和cTnI含量显着下降(P<0.05，P<0.01)，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；优化方2组血清LDH、CK、CK-MB和cTnI含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清LDH、CK、CK-MB与cTnI含量比较

2.2.2 各组大鼠血清AST和ALT表达 表2示，与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠血清AST、ALT及其比值显着升高(P<0.01)；与MI/RI模型组比较，基础方组和优化方1组血清AST、ALT及其比值显着下降(P<0.05，P<0.01)，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，优化方2组则仅有AST/ALT显着下降(P<0.01)。

表2 各组大鼠血清AST、ALT和AST/ALT比较

2.2.3 各组大鼠心肌组织MDA表达 表3示，与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠心肌MDA含量显着升高(P<0.05)；与MI/RI模型组比较，基础方组和优化方1组心肌MDA含量显着下降(P<0.05)，2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，优化方2组变化比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠心肌MDA含量比较

2.2.4 各组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α表达比较 表4示，与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量显着升高(P<0.01)；与MI/RI模型组比较，基础方组血清IL-1β和TNF-α含量显着降低(P<0.05)，优化方1组IL-1β、IL-6和TNF-α指标含量均显着降低(P<0.05，P<0.01)，优化方2组的IL-6和TNF-α含量显着降低(P<0.05，P<0.01)。

表4 各组大鼠血IL-1β、IL-6与TNF-α含量比较

2.2.5 各组大鼠心肌梗死面积 表5图4示，与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠心肌梗死面积显着增加(P<0.01)；与MI/RI模型组比较，基础方组、优化方1组和优化方2组心肌梗死面积均显着减小(P<0.01)。

表5 各组大鼠心肌梗死面积比较

图4 各组大鼠心肌梗死面积比较

3 讨论

3.1 对痰瘀同治方的处方优化

中药处方优化的目标是形成药味更简但疗效更优或基本不变的新处方。目前最常用的处方优化方法为撤药分析法和拆方分析法。撤药分析法即将复方中各个药物轮流剔除并分组实验，用以判断剔除的药物对原本复方药效和不良反应的影响[11]。这种方法比较适合药味较少的复方，如果药味过大则需要进行多次实验，消耗大量的人力、物力，且容易产生较多的误差。拆方分析则以传统中医药理论为指导，按不同治法或君臣佐使的配伍关系，或药物性味的不同，或“药对”关系进行拆方，分解为不同部分进行研究[12]。这是最具中医特色的一种研究方法，然而同撤药分析法一样，缺点为实验次数过多，实验消耗大及所需时间较长。

随着生物技术和信息科学的发展及不断融合，基因组学、蛋白组学、代谢组学等方面积累了大量的组学数据[13]。整合这些组学数据，可以构建关于药物、基因、疾病、靶点之间复杂的药理网络。借助药理网络分析，可以筛选中药活性成分，阐述中药或者方剂的作用机理、探讨疾病的发病机制[14-16]。同时网络具有双向性，这给中药处方优化研究提供了新思路，通过构建药理网络、筛选核心节点，可以反向筛选出核心药物组合，从而大大减少实验次数，缩短实验时间，减少人力和物力支出。因此，本研究在前期研究基础上[2-7]提出了一种新的处方优化方法，借助药理网络分析筛选“成分-靶点-疾病”中的核心节点，得出核心成分群，从而拟定出优化方。该方法首先聚焦在药物间的协同作用上，以群体协同算法为核心，寻找网络中群体与群体之间的关联关系，而非个体与个体之间的关系。其次，当前大多数学者在构建药理网络时，将所有中药在方剂中的药效都做了均一性处理，故在网络中不会体现出差别，将中医君臣佐使方剂配伍理论引入到网络模型的构建中，能够提高模块划分的质量，从而也从侧面证实了中医“君臣佐使”思想对方剂药理作用的影响。从整体上看，该方法与传统方法相比能更清晰地发现网络中的关键节点和关系，从而能提取出更为准确的药物核心成分群，反推出核心药物组合，实现中药方剂的处方优化。

基于以上方法，本研究在构建痰瘀同治方抗心肌缺血再灌注的药理网络的基础上，按照君臣佐使理论对网络中的边进行加权，使用以群体协同计算为核心的方法进行模块划分，得到13个群体协同模块。结合模块分析和加权中心性，分析模块中的核心节点，得到核心成分群，最终反推出优化方1和优化方2。

3.2 优化方的实验验证

现代医学中，MI/RI的发病机制较为复杂，目前认为其主要与氧化应激、炎症反应等多种病理生理变化有关[17]。

生理状态下，绝大多数心肌酶和cTnI在细胞内部维持正常的生理作用，但当细胞受损后，心肌细胞膜通透性改变，心肌酶即释放到血液中，血中的CK、LDH、AST等心肌酶就会升高，胞浆酶释放量增加可反映细胞损伤严重。MDA为氧自由基与细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，常被作为氧自由基生成和造成膜损害的指标[18]。cTnI是心肌组织的一种特有的调节蛋白，可作为敏感和特殊的心肌损伤标志物[19]。本研究显示，MI/RI模型组的CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、MDA和cTnI均显着升高，同时心肌梗死面积显着增加，提示此时心肌细胞严重受损。与MI/RI模型组比较，基础方组及优化方1组CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、MDA和cTnI均显着降低，心梗面积显着减小；优化方2除心肌梗死面积显着降低外，其他指标均变化不明显。结果提示，痰瘀同治方及优化方1在抑制心肌酶释放、抗氧化应激及降低心肌梗死程度等方面对MI/RI具有较好的保护作用。

MI/RI引起心肌细胞内源性的炎症反应，并诱导释放大量炎性因子，从而进一步引起心肌受损[20]。TNF-α是启动炎症级联反应的关键因素，可诱导多种炎症因子和黏附分子的产生；IL-6、IL-1β是关键的促炎细胞因子, 广泛参与机体缺血缺氧、炎症、应激的调控，在急性心肌梗死过程中扮演着非常重要的角色[21]。实验结果显示，再灌注后MI/RI模型组TNF-α、IL-6及IL-1β均显着升高。与MI/RI模型组比较，优化方1组TNF-α、IL-6及IL-1β显着降低，基础方组TNF-α及IL-1β显着降低，优化方2组TNF-α、IL-6显着降低，说明在MI/RI过程中3组均可减少炎症因子的释放，优化方1可能效果更佳。动物实验各项结果显示，优化方1组在抑制血清心肌酶释放、抗氧化应激、减轻炎症因子方面显示出较好的抗MI/RI作用，且效果与痰瘀同治方相当。

综上所述，本研究将基于中医“君臣佐使”理论的加权网络模块划分优化方法应用于痰瘀同治方的处方优化研究中，筛选出优化方1和优化方2，并通过动物实验证实优化方1和原方疗效相当，证实该处方优化方法的有效性和可能性，为中药复方优化提供了一种新思路和新方法。