基于“水不涵木”及“方证相应”探讨肝阳上亢证对机体的影响机制及实验研究❋

孙永康，王新志，刘向哲，王小燕

(1.河南中医药大学，郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000)

肝阳上亢证是临床常见证型，最早记载于《临证指南医案·中风》[1]，可见于高血压病、失眠、甲亢、更年期综合征、慢性脑缺血等多种疾病[2,3]。目前对该证的研究多以病证结合方式为主，如李运伦等[4,5]研究高血压病肝阳上亢证的物质基础以及诊断量表、疗效评价体系的构建；黄德健等[6]借助影像技术观察偏头痛肝阳上亢证及非肝阳上亢证的脑部组织差异；钟广伟等[7,8]研究高血压等疾病肝阳上亢证动物模型下丘脑等组织蛋白质、基因的表达，而对于单纯证型的研究则较少[9]。

肝肾阴虚作为本证的病理基础在现代得到了广泛认可[10]；在肝阳上亢证的诊断标准中也包含肝肾阴虚症状[11]。《素问·阴阳应象大论篇》记载：“肾生骨髓，髓生肝”，叶天士[1]言：“肝为风脏，因精血衰耗，水不涵木，木少滋荣，故肝阳偏亢，内风时起”及张山雷[12]提出“盖真阴若充，肝阳亦必不动，木之动无不本于水之虚”，可见肝有赖于肾脏精血濡养，肾中精血不足导致肾阴虚进而肝失肾之濡养，两脏并虚发为肝肾阴虚、肝阳失于制约，发为肝阳上亢证。故可以认为肾阴虚是肝肾阴虚发生的原因，同时也是导致肝阳上亢证的根本原因。天麻钩藤饮为治疗本证的经典代表方剂，该方由近现代医家胡光慈创立[13,14]。

中医药整合药理学研究平台(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP )V2.0是中国中医科学院中药研究所开发的一种能够以症状为切入点，预测疾病不同证型生物学基础的系统，可为传统理论科学内涵研究提供可能的依据[15,16]。本研究在“水不涵木”及“方证相应”理论指导下，借助TCMIP V2.0平台，以肝阳上亢证临床表现、肾阴虚证临床表现和经典方剂天麻钩藤饮药物作用基础联合预测肝阳上亢证可能对人体的作用机制，并通过动物实验进行验证，这可能为证候生物学基础研究提供一定帮助。本研究通过河南中医药大学实验动物中心动物伦理委员会批准(批号DWLL202105053)。

1 资料与方法

1.1 整合药理学分析

1.1.1 肾阴虚证、肝阳上亢证靶标及天麻钩藤饮药物作用靶标 肾阴虚证、肝阳上亢证临床表现参照全国中医药行业高等教育“十三五”规划教材《中医诊断学》[10]。运用TCMIP V2.0系统“疾病相关分子集及其功能挖掘”模块，筛选出肾阴虚证临床表现所对应英文词条，构建肾阴虚证相关分子库，运用“证候相关分子挖掘及功能分析”模块，筛选出肝阳上亢证临床表现所对应英文词条，构建肝阳上亢证相关分子库；运用“中药(含方剂)靶标预测及功能分析”模块，构建天麻钩藤饮相关分子库[16]。

1.1.2 基因功能富集分析及关联网络可视化展示 TCMIP V2.0系统中镶嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT等多个数据库中蛋白质相互作用信息[16]。运用“中医药关联网络挖掘”中“疾病-证候-方剂”功能，在1.1.1结果基础上，选择肾阴虚证、肝阳上亢证与天麻钩藤饮进行联合药理学分析。根据交集核心网络靶标进行GO富集分析，以及Reactome通路富集分析，GO富集分析包括生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)，在此基础上构建“疾病-证候-方剂-药物-有效成分-核心网络靶标-通路”关联网络。

1.2 实验验证

1.2.1 动物 8周龄SD雄性大鼠，体质量约250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号SCXK(京)2021-0006。大鼠饲养于河南中医药大学实验动物中心，室温(23±2)℃，维持明暗交替，自由摄食和饮水。

1.2.2 药物 附子颗粒(0.7 g/袋，相当于中药饮片6 g，批号1091432)，广东一方制药有限公司生产，购自河南中医药大学第一附属医院。将附子颗粒水浴加热溶解得到附子药液，浓度相当于中药饮片0.2 g/mL。

1.2.3 主要试剂与仪器 蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抗体、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein,CREB)抗体、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)抗体、膜铁转运蛋白(recombinant ferroportin,Fpn)抗体，货号分别为GB11598、GB111052、GB11034B、GB111471，武汉赛维尔生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抗体(货号BSM-33219 M)，北京Bioss生物技术有限公司；转铁蛋白受体(transferrin receptor,Tfr)抗体(货号A18083)，武汉Abclonal科技有限公司；核因子E2相关因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)抗体、血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗体(货号16396-1-AP、27282-1-AP)，武汉三鹰生物技术有限公司。

RT-6100型酶标仪，Rayto生命科学股份有限公司；D3024R型台式高速冷冻离心机，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；JY92-11N型超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；6300型化学发光仪，上海勤翔科学仪器有限公司；NIKON ECLIPSE E100型正置光学显微镜，日本尼康公司；D1008E型掌上离心机、BV-2型垂直电泳仪、BT-2型转印电泳仪，武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2.4 动物分组及干预方法 将12只SD大鼠随机分为对照组及模型组，模型组使用附子药液灌胃，药物剂量相当于生药2 g/(kg·d)，大鼠灌胃剂量按动物体表面积系数折算，动物药物剂量=(人体药物剂量/60 kg)×6.25，灌胃4周；从第5周开始每天灌胃0.9%氯化钠溶液代替治疗，连续2周[17,18]。对照组全程用等量0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.2.5 标本采集 灌胃结束后取材。将麻醉后的大鼠放置于取材板，剪开腹腔皮肤逐步向上打开胸腔；暴露心脏剪开左心耳，使用20 mL注射器经左心室注射0.9%氯化钠溶液；灌注结束后断头处死大鼠，取全脑剥离大脑皮质组织。

1.2.6 观测指标 一般情况观察大鼠巩膜颜色、饮水量、活动量、易激惹程度等。普鲁士蓝染色法检测大脑皮质铁代谢，脑组织切片后依次放入二甲苯、无水乙醇、75%酒精；水洗后使用普鲁士蓝染液染色；中性树胶封片、显微镜镜检、图像采集分析。Western blot法检测HO-1、Nrf2、Tfr、Fpn、PI3K、PKA、CREB、VEGF蛋白表达，皮质组织匀浆，冰上裂解，BCA法检测总蛋白浓度；电泳、转模分别加入HO-1、Nrf2、Tfr、Fpn、PI3K、PKA、CREB、VEGF一抗(均为1:1 000)，4 ℃孵育；TBST洗脱，室温下加入二抗(1:3 000)。ECL显色，Alpha软件系统分析目标条带灰度值。

2 结果

2.1 整合药理学分析结果

2.1.1 肝阳上亢证及肾阴虚证临床表现及对应英文词条 根据肝阳上亢证临床表现，筛选出29个对应词条；根据肾阴虚证临床表现，筛选出25个对应词条(见表1)。

表1 肝阳上亢证及肾阴虚证临床表现及对应英文词条

2.1.2 关联网络分析 表2示，肾阴虚证、肝阳上亢证与天麻钩藤饮联合药理学分析获得核心网络靶标564个，其中核心节点209个，部分核心节点展示。GO富集分析生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)分别得到前20个条目：BP结果显示，肝阳上亢证参与机体的生物过程，包括对细胞增殖、细胞凋亡、基因表达的双向调控，参与细胞钙离子稳态、衰老、DNA转录、细胞凋亡、信号传导，和对有机物质反应、蛋白质自磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ转录的正向调控等；CC富集结果显示，该证可能作用的部位包括细胞质、细胞质膜、细胞核、核基质、内质网、谷氨酸能突触、突触前膜的整体成分、突触后、神经元胞体、树突、树突棘、线粒体、线粒体呼吸链复合物Ⅱ等，包括细胞的多个部位及突触、神经元、线粒体等结构的多个部分；MF富集结果显示，该证能够催化蛋白质、酶、药物、转录因子、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、血清素、核苷酸及含蛋白复合物的结合，影响核受体、蛋白质异源二聚体、蛋白质同源二聚体、神经递质受体、G蛋白偶联5-羟色胺受体、类固醇激素受体、激酶及蛋白激酶活性。Reactome通路富集前20条通路，包含VEGF受体(VEGF receptor,VEGFR)2、Rapidly accelerated fibrosarcoma(Raf)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、PI3K、3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇蛋白(PIP3 protein,PIP3)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、信号传导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)、PKA、CREB1等相关通路(见图1)。

表2 基于肾阴虚证、肝阳上亢证、天麻钩藤饮联合药理学分析所得部分核心节点展示

图1 肝阳上亢证核心节点Reactome富集分析前20条通路

2.1.3 关联网络可视化展示由图2来关联网络中包含11味中药86个中药有效成分210个核心节点28条通路。其中根据实验结果增加了核心节点HO-1和通路Ferroptosis。

图2 基于肾阴虚证、肝阳上亢证、天麻钩藤饮联合构建的“疾病-证候-方剂-药物-有效成分-核心网络靶标-通路”关联网络

2.2 实验结果

2.2.1 一般情况 灌胃结束后，模型组较对照组大鼠表现出易激惹程度、饮水量、活动增加等表现，提示造模成功。

2.2.2 大鼠皮质普鲁士蓝染色结果 普鲁士蓝染色显示，模型大鼠皮质细胞外有多个蓝色斑点，提示细胞外存在铁沉积(见图3)。

图3 大鼠皮质普鲁士蓝染色结果(左侧为对照组，右侧为模型组)

2.2.3 Western blot法检测HO-1、Nrf2、Tfr、Fpn、PI3K、PKA、CREB、VEGF蛋白表达结果 Westernblot检测结果见图4，模型组大鼠皮质组织铁代谢相关蛋白Fpn、Nrf2、HO-1较空白组表达有升高趋势，Tfr蛋白表达有所下降；模型组大鼠PI3K蛋白表达减少，PKA、CREB、VEGF蛋白表达增加。

图4 大脑皮质相关蛋白(K为对照组，M为模型组)

3 讨论

目前对于单纯肝阳上亢证型，尤其是该证对脑组织影响的研究较少。笔者结合肝阳上亢形成的根本原因及经典名方天麻钩藤饮，以“水不涵木”及“方证相应”为指导，借助TCMIP V2.0平台，寻找出证候临床表现对应的词条，根据词条及药物有效成分筛选核心交集靶标，进而富集分析得到该证对机体产生影响可能作用的部位、生物过程等，并筛选出富集程度较高的通路，构建出“疾病-证候-方剂-中药-中药药效成分-核心靶点-通路”网络。网络药理学预测结果受数据库等因素影响，存在一定的限制[19]。笔者还根据实验结果补充了铁代谢相关靶点及通路，对数据库现有内容进行了补充。本研究以中医理论为指导，结合该证的根本病因及方药，能够更准确、更合理地预测该证作用机制，缩小了预测范围、增强了可信度。

富集分析结果显示，VEGFR2、Raf/MAPK、PI3K、PIP3/Akt、STAT3、PKA、CREB1等相关通路富集程度较高。VEGF/VEGFR2信号传导通路可以促进血管新生，是重要的正性调控通路[20]；而缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1α介导的VEGFA/VEGFR2可以影响胞质紧密黏连蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)的降解，进而使血管通透性增强，血脑屏障受到破坏[21]；推测本研究中VEGFR2主要影响血管通透性，但预实验结果发现模型大鼠VEGF表达也有变化，故其可能通过上述两种机制影响脑组织。有研究报道，Raf/MAPK通路可促进记忆功能稳定，促进细胞增殖和细胞存活[22-24]。成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)是PI3K相关通路的核心节点，FGF1-PI3K-Akt通路可以影响心肌细胞增殖[25]，可能该证对神经细胞也有促进增殖的作用。PIP3/Akt信号通路可能与细胞的线粒体功能和细胞活力有关[26]；磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)介导的PIP3/Akt 通路可能与多种神经退行性疾病及衰老有关[27,28]，这为进一步研究本证与疾病的联系提供指导。腺苷酸环化酶6抗体(adenylate cyclase 6,Adcy6)、 R1A of the protein kinase A(RKAR1A1A)是PKA相关通路的核心节点，Adcy6可影响环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量，进而影响PKA，使CREB磷酸化增强，从而影响肝脏葡萄糖代谢[29]。这与高血压肝阳上亢证葡萄糖代谢异常的结果相符合[30]；PRKAR1A可影响PKA活性，进而影响CREB、Akt，促使下游凋亡相关基因BCL2的表达[31]。核心节点PRKACA(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha)与PKA、CREB1相关通路均有联系，研究显示，低氧预处理可减轻低氧暴露力竭小鼠心肌损伤，其机制可能通过活化腺苷受体，进而影响G蛋白偶联、胞内腺苷酸环化酶及单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)生成，增加细胞内cAMP含量，引起PRKACA/B及 CREB1等相关分子表达上调[32]，这提示肝阳上亢证可能与组织缺氧损伤有关。

本研究采用附子灌胃的方法建立肝阳上亢证模型，对与脑病相关的VEGFR2血管相关通路、PI3K信号通路、PKA信号通路、CREB1信号通路相关蛋白进行了检测，结果发现模型大鼠皮质PI3K、PKA、CREB、VEGF蛋白表达均存在变化，在后续工作中可通过这些通路开展研究。笔者还根据当前的研究热点检测了铁代谢相关指标，发现模型大鼠与正常大鼠比较，大脑皮质细胞外出现铁沉积，铁代谢相关蛋白HO-1、Fpn、Nrf2升高，Tfr降低，推测肝阳上亢证通过激活Nrf2，减少Tfr介导的铁从胞外向胞内的转运，增加Fpn介导的转出，导致铁从细胞内向细胞外转运，这可能是模型大鼠表现出易激惹、兴奋等症状的物质基础，同时该变化过程与阿尔茨海默病、帕金森病等疾病中铁转运的方向相反，故该证还可能与这些疾病的防治存在联系[33,34]。

综上所述，肝阳上亢证可能通过多靶点、多通路、多机制对机体产生影响；对大脑皮质PI3K、PKA、CREB、VEGF相关通路有明确影响作用，还能够促使大鼠皮质细胞内铁向细胞外的转运。在后续研究中，计划深入探索肝阳上亢证通过Nrf2相关信号通路影响脑组织铁代谢的机制，并开展实验确定以附子为代表的温阳法对阿尔茨海默病等疾病的治疗作用。