拔毒生肌散调控Keap1/Nrf2通路促进糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的机制研究❋

王双勋,李大勇

(1.辽宁中医药大学,沈阳 110847;2.辽宁中医药大学附属医院,沈阳 110032)

糖尿病皮肤溃疡属中医消渴病变证之一,中医认为其主要病机为正气亏虚,伏毒内侵,遇感诱发[1]。祛腐生肌是治疗皮肤溃疡的重要方法。拔毒生肌散是临床祛腐生肌的经典药物,源于清代名医赵廷海所着《救伤秘旨》,“凡破伤不论新久,敷之极效”[2]。本方在临床广泛用于治疗糖尿病足溃疡、褥疮、肛瘘、臁疮等慢性溃疡,疗效显着[3-4],但其作用机制研究尚不多见。本研究通过观察拔毒生肌散对糖尿病大鼠溃疡肉芽组织的病理形态、真皮层胶原纤维沉积、CD34标记血管内皮细胞的影响,并分析拔毒生肌散对糖尿病大鼠溃疡肉芽组织中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Kelch-like ECH-associated protein,Keap)-1/核因子E2相关因子(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)通路相关蛋白与mRNA的调节作用,拟探讨拔毒生肌散促进糖尿病皮肤溃疡愈合的机制。本研究已通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审批,编号:21000042021078。

1 材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠60只,雄性,体质量220～260 g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司,实验动物许可证号:SCXK(辽)2020-0001。动物饲养于辽宁中医药大学SPF级动物实验中心,普通饲料喂养,自由饮水,环境温度(25±1)℃、湿度50%～60%,光照时间早7点～晚7点。

1.2 药物

拔毒生肌散,购于健民集团叶开泰国药(随州)有限公司,国药准字:Z20044390,散剂,每瓶3 g;一效散,购于辽宁中医药大学附属医院,批号:辽药制字Z05010275,散剂,每袋50 g。一效膏,由香油和一效散按1:1比率自行调配。康惠尔清创胶购于丹麦康乐保公司,批号:国食药械(进)字2008第3640515(更),每盒25 g。

1.3 主要试剂

链脲佐菌素(streptozocin,STZ),北京索莱宝科技有限公司,货号 630E024。β-actin抗体(货号4970)、KEAP1抗体(货号7705)、NRF2抗体(货号33649)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记兔二抗(货号7074),美国Cell Signaling公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度测定试剂盒(货号P0012)、Western细胞裂解液(货号P0013)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(货号P0012AC)、超敏增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒(货号P0018),上海碧云天生物技术有限公司;RNA提取试剂盒(货号9767)、DNA提取试剂盒(货号RR047A)、定量PCR试剂(货号RR820A),日本TaKaRa公司。

1.4 主要仪器

MR1822低温高速离心机,法国Jouan SA公司;DYY-12电泳仪,北京市六一仪器厂; RM2016病理切片机,上海徕卡仪器有限公司;Giotto染色机,意大利DIAPATH公司;Pannoramic DESK/MIDI/250/1000全景切片扫描仪,匈牙利3DHISTECH公司;Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪,德国Agilent Technologies公司;BioDrop Duo核酸蛋白分析仪,英国Bio Drop公司。

2 方法

2.1 模型制备

2.1.1 糖尿病大鼠模型制备 适应性喂养7 d后,将60只大鼠随机分为正常对照组、模型组、拔毒生肌散组、一效膏组、清创胶组,每组12只。造模前12 h禁食不禁水,称体质量,测血糖。正常对照组大鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液,喂食普通饲料28 d。另外4组大鼠以单次30 mg/kg剂量腹腔注射2%的STZ溶液,72 h后尾尖采血测随机血糖,血糖≥16.7 mmol/L则视为糖尿病模型建立成功。造模成功后继续用高糖高脂饲料(配方:66.5%大小鼠维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+1%胆酸钠)喂食28 d。

2.1.2 背部皮肤溃疡大鼠模型制备 28 d后麻醉各组大鼠并于腰背正中部剃毛备皮,用直径为2 cm的印章蘸龙胆紫标记圆形切口线。于动物手术台进行手术,碘伏消毒剃毛区,铺无菌孔巾,沿标记线切开皮肤,深达深筋膜层浅层,剪除皮肤组织。纱布压迫止血。一层凡士林纱布和两层无菌纱布外敷创口,胶布包扎。

2.2 药物干预

各组大鼠于术后第2天开始换药。换药方法:碘伏消毒,正常对照组和模型组大鼠用0.9% 氯化钠溶液冲洗溃疡面;拔毒生肌散组大鼠于溃疡面均匀外敷约6 mg药粉;一效膏组大鼠于溃疡面均匀外涂约2 mm厚度药膏;清创胶组大鼠于溃疡面均匀外涂约2 mm厚度凝胶。涂药后均用1层凡士林纱布和2层无菌纱布外敷创口,胶布包扎固定。每日换药1次,共治疗14天。换药期间正常对照组大鼠喂食普通饲料,另4组大鼠继续喂食高糖高脂饲料。

2.3 取材

各组大鼠于治疗第7天和第14天时分别测算溃疡面愈合率。第7天测算完成后每组随机选取6只大鼠,麻醉处死,无菌手术操作,切取溃疡创面肉芽组织,面积约1 cm×0.5 cm,一半组织浸泡于多聚甲醛溶液,备做(hematoxylin and eosin,HE)染色、Masson染色和CD34免疫组化,另一半组织液氮冷冻后于-80 ℃冰箱冻存,备做Western blot和荧光定量PCR检测。第14天时处死剩余大鼠,具体操作内容同第7天。

2.4 观察指标

2.4.1 溃疡面愈合率 药物治疗第7天和第14天,分别应用Image-pro plus 6.0软件计算各组大鼠溃疡面愈合率。公式如下:溃疡面愈合率=[(初始溃疡面积-拍照时溃疡面积)/初始溃疡面积]×100%。

2.4.2 苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色 药物治疗第7天和第14天,分别观察各组大鼠溃疡创面区域的病理学变化。将固定于多聚甲醛中的组织取出,包埋,切片,脱蜡至水,苏木素染色,伊红染色,脱水,封片。分析溃疡创面肉芽组织成纤维细胞、新生血管、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、表皮细胞等变化。

2.4.3 Masson染色 每组随机选取3只大鼠,药物治疗第14天时采用Masson染色观察溃疡创面肉芽组织中真皮层胶原纤维的沉积情况。采用Aipathwell软件分析胶原纤维阳性面积比。公式如下:胶原纤维阳性面积比=阳性面积/组织面积×100%。

2.4.4 CD34免疫组化染色 每组随机选取3只大鼠,评估药物治疗第14天时溃疡创面肉芽组织的血管新生情况。将包埋好的蜡块切片,脱蜡至水,抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,血清封闭,滴加1:200大鼠CD34一抗,加对应1:100二抗,二氨基苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色,细胞核复染,脱水,封片。通过CD34标记溃疡创面肉芽组织中的血管内皮细胞,阳性产物显示为棕黄色,苏木素复染后细胞核为蓝色。采用Aipathwell软件计算阳性细胞比率。公式如下:血管内皮阳性细胞比率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

2.4.5 Western blot检测 药物治疗第7天和第14天,分别检测各组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1、Nrf2的蛋白表达。取出冻存的样品进行总蛋白提取,BCA法检测蛋白浓度,电泳,转模,5%脱脂奶粉封闭,加入1:1000大鼠Nrf2、Keap1一抗,添加1:5000二抗,显影,放入成像仪中拍照。

2.4.6 荧光定量PCR检测 药物治疗第7天和第14天,分别检测各组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1、Nrf2 mRNA的表达水平。取出冻存样本,提取总RNA并检测浓度,采用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,配置反应体系后加入PCR仪进行扩增,采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。各引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠溃疡面愈合率比较

药物治疗第7天和第14天,与正常对照组比较,模型组大鼠溃疡面愈合率显着下降(P<0.01)。与模型组比较,拔毒生肌散组、一效膏组、清创胶组大鼠溃疡面愈合率显着升高(P<0.01)。各治疗组组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

注:与正常对照组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01;7天时每组检测12只大鼠,14天时每组检测6只大鼠

3.2 各组大鼠HE染色结果

药物治疗第7天和第14天,与正常对照组比较,模型组大鼠溃疡创面区域可见较多的坏死细胞碎片(绿色箭头)、淋巴细胞与中性粒细胞浸润(红色箭头);与模型组比较,拔毒生肌散组、一效膏组和清创胶组大鼠溃疡边缘可见较多新生的表皮层(蓝色箭头),肉芽组织中成纤维细胞与纤维细胞(黑色箭头)、新生血管(黄色箭头)较多,而坏死细胞碎片、淋巴细胞与中性粒细胞浸润较少,见图2。

图2 各组大鼠皮肤溃疡创面肉芽组织HE染色结果

3.3 各组大鼠Masson染色结果

药物治疗第14天,与正常对照组比较,模型组大鼠愈合的溃疡创面肉芽组织中胶原纤维蓝染少,胶原纤维排列紊乱,分布稀疏。与模型组比较,拔毒生肌散、一效膏组和清创胶组大鼠溃疡创面肉芽组织中蓝染的胶原纤维沉积较多,排列相对整齐有序,见图3。与正常组比较,模型组大鼠溃疡创面肉芽组织胶原纤维阳性面积比显着降低(P<0.01)。与模型组比较,拔毒生肌散组、一效膏组、清创胶组大鼠溃疡创面肉芽组织胶原纤维阳性面积比显着增加(P<0.05),见图4。

图3 各组大鼠药物治疗第14天皮肤溃疡创面肉芽组织Masson染色结果 (×200)

注:与正常对照组比较**P<0.01;与模型组比较#P<0.05

3.4 各组大鼠CD34免疫组化检测结果

药物治疗第14天,与正常对照组比较,模型组大鼠溃疡创面肉芽组织中CD34标记新生血管较少,管径较细。与模型组比较,拔毒生肌散组、一效膏组、清创胶组大鼠溃疡创面肉芽组织中CD34标记新生血管多,管径较粗,见图5。与正常对照组比较,模型组大鼠溃疡创面肉芽组织中CD34标记的血管内皮细胞阳性细胞比率显着降低(P<0.01)。与模型组比较,拔毒生肌散组、一效膏组、清创胶组大鼠溃疡创面肉芽组织中CD34标记的血管内皮细胞阳性细胞比率显着升高(P<0.01),见图6。

图5 各组大鼠药物治疗第14天皮肤溃疡创面肉芽组织CD34免疫组化染色图(×200)

注:与正常对照组比较**P<0.01;与模型组组比较##P<0.01

3.5 各组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1、Nrf2蛋白检测结果

药物治疗第7天和第14天,与正常对照组比较,模型组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1蛋白相对表达显着升高(P<0.01),Nrf2蛋白相对表达显着降低(P<0.01)。与模型组比较,拔毒生肌散组、一效膏组和清创胶组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1蛋白相对表达显着降低(P<0.01),Nrf2蛋白相对表达显着升高(P<0.01),见图7、图8。

注:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)

注:核因子E2相关因子(Nrf2)

3.6 各组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA检测结果

药物治疗第7天和第14天,与正常对照组比较,模型组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1 mRNA相对表达显着升高(P<0.01),Nrf2 mRNA相对表达显着降低(P<0.01)。与模型组比较,拔毒生肌散组、一效膏组和清创胶组大鼠溃疡创面肉芽组织中Keap1 mRNA相对表达显着降低(P<0.01),Nrf2 mRNA相对表达显着升高(P<0.01),见图9。

注:与正常对照组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01

4 讨论

近年来,临床代谢类疾病患者数量不断增加,其中糖尿病性溃疡已超越创伤性溃疡,成为慢性溃疡的主要原因。糖尿病性溃疡的存在可能导致糖尿病患者面临严重的致残和致命后果。在我国,糖尿病皮肤溃疡患者的特点为高龄、教育水平低、经济收入有限,血糖控制不佳,并常伴有糖尿病肾病、心血管疾病、视网膜病变等糖尿病并发症。及时治愈糖尿病皮肤溃疡对避免深层组织(如肌腱、肌肉、骨骼)的损伤至关重要,可进一步防止截肢和致残,对患者及其家庭具有重要意义[5-6]。

中医将糖尿病皮肤溃疡归为“脱疽”范畴,《灵枢·痈疽》记载其“发于足趾,名脱痈。其状赤黑,死不治;不赤黑,不死。不衰,急斩之,不则死矣”[7]。明代陈实功在《外科正宗·脱疽》中提到“夫脱疽者,外腐而内坏也。此因平昔浓味膏粱熏蒸脏腑,丹石补药消烁肾水,房劳过度,气竭精伤……多致阳精煽惑,淫火猖狂,其蕴蓄于脏腑者,终成燥热火症,其毒积于骨髓者,终为疽毒阴疮”[8],并记载了解毒济生汤、阴阳二气丹、清神散、雌雄霹雳火等方剂,提出可将脱疽分为初期、溃烂期、恢复期3期,分期治疗。中医重视外治之法,以祛腐生肌、煨脓长肉为治疗糖尿病皮肤溃疡的主要治法。拔毒生肌散具有拔毒祛腐、敛疮生肌、止血止痛的功效。其君药红粉、黄丹具有拔毒提脓、生肌敛疮之效;臣药轻粉可助君药拔毒生肌;佐药煅石膏、炉甘石和煅龙骨能清热收湿敛疮、减君药毒性;使药冰片、虫白蜡可助清热止血、止痛、消肿生肌之功。查春丽[9]报道应用拔毒生肌散治疗糖尿病足感染性溃疡,疗效显着。路丽艳[10]研究证明炉甘石内的锌成分具有抗氧化应激的作用,能够降低汞对人体的损害。

本实验采用腹腔注射STZ结合喂食高脂高糖饲料的方法进行糖尿病模型复制,模型大鼠出现多饮、多尿、毛发枯黄、精神萎靡的表现,且在造模后第28天体质量降低,血糖升高,说明模型复制成功。使用拔毒生肌散治疗后,糖尿病大鼠溃疡创面愈合率、皮肤溃疡肉芽组织胶原纤维阳性面积比例明显高于模型组,提示拔毒生肌散对糖尿病皮肤溃疡具有显着的治疗作用。另外本研究选用一效膏和清创胶作为治疗方案对照,结果显示拔毒生肌散、一效膏与清创胶对糖尿病皮肤溃疡的治疗效果相当。一效膏是辽宁中医药大学附属医院的院内制剂,由“疮王”王品三所创,临床用于治疗糖尿病足、褥疮等慢性创面,临床疗效显着[11-13]。本团队研究发现一效膏能够上调创面肉芽组织中Ⅰ型胶原与纤维结合蛋白的表达,促进CD31、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧诱导因子 (hypoxia inducible factor,HIF)-1α、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的基因表达,促进糖尿病皮肤溃疡创面的愈合[14-16]。康惠尔清创胶主要成分为羟甲基纤维素钠、藻酸钙和纯化水,可以使慢性创口自溶性清创并湿润环境,促进肉芽的生长和上皮细胞的爬行。康惠尔凝胶与中医的祛腐生肌药功效相似,临床广泛应用于糖尿病性溃疡、压疮等慢性创面的治疗[17-18]。与此两种阳性对照药比较,本实验结果证明拔毒生肌散对创面的愈合也具有促进作用。

糖代谢紊乱导致的氧化应激状态可通过破坏DNA结构、氧化蛋白质、降解细胞外基质成分导致细胞凋亡[19]。糖尿病皮肤溃疡的患者体内出现氧化系统和抗氧化系统失衡现象,氧化应激损伤严重。Keap1/Nrf2通路是抗氧化应激的通路,也是糖尿病皮肤溃疡实验研究的热点,多种药物通过调控此通路促进糖尿病皮肤溃疡的愈合[20-23]。拔毒生肌散对模型大鼠肉芽组织中Keap1和Nrf2的蛋白与mRNA表达具有较好的调节作用,可能通过抗氧化的Keap1/Nrf2通路促进糖尿病皮肤溃疡的愈合。另外糖尿病大鼠模型的溃疡创面表现为慢性创面特点:炎症明显,肉芽组织少,肉芽色灰白,易出血。其溃疡面愈合率明显低于正常组,差异具有统计学意义。HE染色、Masson染色和CD34免疫组化结果均显示模型组与糖尿病患者皮肤溃疡病理表现相似。拔毒生肌散组相对糖尿病模型组大鼠组织病理学改善明显,提示拔毒生肌散具有消炎、生肌、促进毛细血管新生的作用。

综上所述,拔毒生肌散可以通过降低炎性细胞浸润、促进成纤维细胞和胶原纤维的沉积、促进血管新生以及调控抗氧化的Keap1/Nrf2通路等方面促进糖尿病大鼠皮肤溃疡创面的愈合。今后计划结合创面湿性愈合理论,进一步研究拔毒生肌散的水凝胶制剂,使这一清代名方能够结合现代制药工艺,提高疗效,造福广大糖尿病皮肤溃疡等慢性创面患者。