辛娟娟,张雯晰,刘 群,赵玉雪,周 晨,吴 爽,赵春晓,张 颖,喻晓春,高俊虹
(中国中医科学院针灸研究所,北京 100700)
近年来,心血管疾病已成为严重危害人类健康的常见病,具体包括高血压、心肌病、心绞痛等,在临床与基础研究领域受到越来越多的关注。尤其在高血压及其并发症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌疾病以及心内膜疾病等方面,相关研究持续增加[1-4]。中医领域也日益重视与心血管疾病相关的针灸和中药治疗方法,研究人员对这些方法在心血管疾病管理中的效应和机制进行了深入研究[5-8]。其中,形态学病理观察是心血管实验研究中最常用的检测指标之一。本课题组在针灸心血管效应机理的研究过程中,需要观察电针对自发性高血压大鼠左心室心肌组织形态学的影响及相关细胞因子、生长因子或蛋白分子在其中的介导作用[9-11]。因此,灌注固定和取材是本研究中获取理想的心血管形态学图片的关键技术环节。常规形态学实验多采取多聚甲醛直接浸泡固定或在体心脏灌流的方式进行心肌取材,见图1,但常带来心脏血液冲洗不干净及心肌组织夹伤破损等问题,不利于包埋制片及后期的染色观察,从而影响采用HE染色、免疫组织化学、荧光免疫组织化学染色等方法对大鼠心肌组织进行实验研究。然而,这些实验方法在针灸、针药结合或药物心血管效应机理研究中均发挥重要作用。因此,课题组设计了一种结构简单、易于操作的适用于心肌组织形态学研究的灌注取材装置及方法,旨在克服上述问题,为心血管疾病的基础研究提供一种新的形态学技术和方法支持。
注:1.蠕动泵(包括电源和控制按钮),2.三通管,3.甲醛管,4.0.9%氯化钠溶液管,5.0.9%氯化钠溶液,6.4%多聚甲醛固定液,7.动脉夹,8.大鼠,9.灌流针头图1 常规的在体大鼠心脏灌注系统实验装置整体结构示意图
1 常规左心室心肌组织取材的失败尝试
在实验研究中,为了观察电针干预后各组大鼠左心室心肌组织相关蛋白、细胞因子等的荧光分布情况,需要对左心室心肌组织进行固定、切片及染色。主要使用了以下方法进行尝试。
1.1 多聚甲醛直接浸泡固定法
先用10%乌拉坦(1 mL/100 g)对实验大鼠进行腹腔麻醉,取左心室心肌组织靠近心尖1/3部位,取下的组织放置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,然后置于含25%蔗糖的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中,在4 ℃冰箱放置约2 d,待心肌组织自然下沉后进行切片。使用恒冷箱摇臂式冰冻切片机将心肌组织制成矢状切片,厚度20 μm,分别按顺序直接粘贴在阳离子载玻片上。检测的指标分别为:I型胶原蛋白(collagen I, CoI)及鬼笔环肽(phalloidin,PHA)。采用该方法虽然不会损伤左心室心肌组织,但在大鼠心脏浸泡过程中很难清除心肌组织内的血液,而后者具有很强的自发荧光,在检测荧光信号时会产生较强的背景信号,直接影响结果的准确性及图片质量,见图2。
注:大鼠左心室心肌组织I型胶原蛋白(CoI)的免疫荧光表达及鬼笔环肽(PHA)的免疫荧光表达;黄色箭头分别指向心脏中残留的血液及自发荧光图2 应用多聚甲醛直接浸泡固定法制作的心肌组织切片
1.2 常规在体心脏灌流取材法
如图1所示,先将甲醛管和0.9%氯化钠溶液管分别插入广口瓶中液面以下,按大鼠体质量,用10%乌拉坦(1 mL/100 g)进行腹腔注射麻醉,开胸暴露心脏,迅速切开肋骨,剪去横膈膜,暴露心脏,将灌流针从心尖部斜向左上方插入升主动脉,用动脉夹将灌流针固定在心脏上,并快速剪开右心耳。该过程一般需要使用4%的多聚甲醛持续灌流15 min左右,以大鼠出现四肢、尾巴抽搐,肝脏发白、内脏鼓起为灌注成功的标志。但是使用该方法后,主动脉夹和灌流针头直接破坏了需要观察的左心室区域,这也是获取左心室部位取材时面临的最大问题,见图3。
注:大鼠左心室心肌组织I型胶原蛋白(CoI)的免疫荧光表达及鬼笔环肽(PHA)的免疫荧光表达;黄色箭头指示心肌组织结构损伤图3 常规在体心脏灌流取材法制作的心肌组织切片
1.3 更改灌注针位置的在体心脏灌流取材方式
为避免常规在体心脏灌流取材法灌注针头对左心室心肌组织的损伤,将灌注针头从心尖部改为从右心室部偏移向上方插入升主动脉,但采用该方法会导致灌流液的冠脉循环不充分,易出现心肌组织灌注固定不完全,且有血液,效果不佳,见图4。
注:大鼠左心室心肌组织I型胶原蛋白(CoI)的免疫荧光表达及鬼笔环肽(PHA)的免疫荧光表达情况;黄色箭头指示杂质图4 在体心脏灌流取材方式更改灌注针位置后制作的心肌组织切片
2 离体大鼠心肌组织灌流取材新型装置的组成与设计思路
2.1 实验装置组成
本实验装置属于实验室技术设备领域,具体是一种用于大鼠心肌组织灌流、取材和固定的装置和方法。如图5所示,该装置包括蠕动泵(Longer Pump,BT300-2J,上海保定兰格恒流泵有限公司),塑料泡沫箱,废液收集托盘,主动脉灌注针头,动脉夹,甲醛管,有钙台氏液管。其中,动脉针头垂直于泡沫纸箱侧面,需要在塑料泡沫箱的后侧挖一个洞,以确保将心脏挂置于动脉针头时,避免碰到箱壁。
注:1.蠕动泵(包括电源和控制按钮);2.蠕动泵三通管;3.甲醛管;4.台氏液管;5.有钙台氏液;6.4%多聚甲醛固定液;7.导管;8.装置三通管;9.注射器;10.大鼠主动脉针头;11.动脉夹;12.废液收集盒;13.塑料泡沫箱图5 改良的适用于大鼠心肌组织灌流取材的实验装置整体结构示意图
2.2 设计思路
本研究设计一种结构简单、易于操作的适用于心肌组织形态学研究的灌流取材装置及方法,以克服常规在体心脏灌流方式取材导致的心肌组织损伤及心脏中残留血液等问题。该装置的主要改进基于结合离体心脏主动脉插管逆行灌注原理与多聚甲醛固定液固定的技术,完成对心肌组织的冲洗、灌注和固定。
3 大鼠心肌组织灌流取材实验装置的使用方法
3.1 实验前准备
首先准备好大鼠,有钙台氏液,8%甲醛,10%乌拉坦,25%蔗糖溶液,0.9%氯化钠溶液,纯水,称重器,大托盘,小托盘,大镊子,两个小弯镊子,动脉夹,大剪刀,小剪刀,15 mL离心管,缝合线。然后在5 mL注射器内注入1 mL有钙台氏液。将动脉针头放在去离子水中浸泡15 min。最后,将蠕动泵及软管组装好并用纯水清洗一遍,将甲醛和有钙台氏液注满软管,动脉针头应垂直于泡沫纸箱侧面。
3.2 主要液体配制
3.2.1 配制有钙台氏液 配方:蒸馏水(500 mL)、氯化钠(4 090.8 mg)、氯化钾(201.3 mg)、氯化镁(47.6 mg)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(1 191.5 mg)、葡萄糖(900.8 mg)、磷酸氢钠(72 mg)。按上述配方将液体配好后,加入1 mol/L的氯化钙0.65 mL,过滤,通氧气20 min,调pH值到7.4,即得所需要的有钙台氏液。
3.2.2 配制8%多聚甲醛溶液 将多聚甲醛80 g加入1 000 mL双蒸水中,80 ℃匀速搅拌3 h,待液体由浑浊变清后,加入少量NaOH粉末以加速甲醛完全溶解,继续搅拌1 h,待甲醛完全溶解,液体变为澄清时,滤纸过滤。8%甲醛配制完毕后,临灌流时用0.2 mol/L的 PBS稀释成4%多聚甲醛溶液即可。
3.3 动物准备及心脏取材
按大鼠体质量,先用10%乌拉坦(1 mL/100 g)进行腹腔麻醉,观察大鼠呼吸、角膜反射、肌肉松弛程度和疼痛反应,判断麻醉生效后,剑突下开口,沿左右肋缘横向剪开腹前壁,再依次沿左右腋中线纵向剪开两侧胸壁,将胸壁翻至头侧,打开心包膜,暴露心脏。左手拇指和食指轻轻提起心脏,暴露心底血管,迅速将其剪断(注意要留出较长的动脉血管,以便后续实验操作),取出的心脏立即放入4 ℃ 0.9%氯化钠溶液中,快速清理心脏表面多余组织。
3.4 主动脉插管
用2个镊子将主动脉夹起套在动脉针头上,同时打开蠕动泵,以4 mL/min的速度注入有钙台氏液,动脉夹夹紧套在动脉针头上的主动脉,再用缝线结扎固定。注意:首先,主动脉插管深浅应适宜,过浅灌流液易从主动脉分支漏出,过深会挡住冠状动脉入口甚至损伤主动脉瓣,瓣膜关闭不全则会导致冠状动脉灌流不充分。动脉针头插入深度一般以右心房上缘约 2 mm、不超过主动脉瓣口为宜。其次,有钙台氏液的注入速度要慢,让液体缓慢滴下,防止形成气栓堵塞冠状动脉。
3.5 灌流取材与固定
将有钙台氏液流速调至6 mL/min,使心脏复跳,血液全部泵出(注意:用定时器定时4 min,以血液全部泵出为准,如果泵血不充分,可以适当按压心脏助血液泵出)。血液完全泵出后,调动三通管至多聚甲醛方向,以6 mL/min的速度定时6 min;计时结束后,关闭蠕动泵。灌注结束后分割心脏,切取左心室心肌组织中靠近心尖1/3部位,置含4%多聚甲醛和0.1 mol/L PBS(pH 7.4)的固定液中后固定5 h,转移到含25%蔗糖的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中,4 ℃冰箱放置约2 d,待心肌组织自然下沉后进行切片,按常规荧光免疫组织化学染色法,组织标本用荧光显微镜观察和拍照,图片用Adobe photoshop CS 5和Adobe illustrator CC图像编辑软件进行整理和标注。
4 应用案例展示
图6为通过该新型装置及方法获取的一只大鼠的心肌组织CoI荧光表达图像。本实验中,PHA主要用于呈现心肌组织基本结构,其显示为绿色(图6B);CoI用于标记心肌组织中I型胶原的荧光表达,显示为红色(图6C);4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)用于标记细胞核,其显示为蓝色,见图6D。
A.大鼠左心室心肌组织I型胶原蛋白(CoI)、鬼笔环肽(PHA)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐( DAPI)免疫荧光共表达;B.大鼠左心室心肌组织PHA的免疫荧光表达;C.大鼠左心室心肌组织CoI染色;D.大鼠左心室心肌组织DAPI染色图6 应用大鼠心肌组织灌流取材实验装置及方法制作的心肌组织切片
5 大鼠心肌组织灌流取材实验装置及方法的优点与局限
优点:该装置通过逆行主动脉灌流方式,解决了传统心脏灌流方式取材导致心肌组织损伤的问题,制出的切片完整、美观,有利于心血管药理及针灸心血管效应机理的实验研究;通过主动脉插管逆行灌注原理,该装置可提供营养物质,使心脏保持跳动,让血液充分泵出,可将大鼠心脏中的血液冲洗干净,解决了冲洗不完全、血液滞留在心脏组织中引起的杂质多,染色不均等非特异性染色的问题,保证了后续染色、切片等实验的成功进行;在挂置心脏的底部设有废液收集托盘,可有效收集实验废液,避免环境污染;结构简单、成本低廉、使用方便。该装置采用塑料泡沫箱改装,结构简单,因此成本较低,且可反复多次利用,节约资源,见图5。另外,使用该装置及方法,因只局部灌注心脏,而非整个大鼠,减少了多聚甲醛的用量且易于实验人员操作,提高了实验成功率,从而避免了实验动物的浪费,节约了成本。
局限:该装置及方法只局限于心肌组织的取材,因其采用的离体心脏灌流方式,只灌注于心脏局部,而不能灌注于实验动物其他脏器或皮肤组织。因此该装置及方法只适用于心血管效应机理研究相关的形态学观察。
6 结语
通过采用这一改进的新型装置和灌流方法,成功保证了在心血管效应机理相关的实验研究中对左心室心肌组织的取材完整性。与常规在体心脏灌流固定方式相比,避免了心肌组织中残留血液及灌注针头对心肌组织造成的损伤,所制备出的切片更完整、美观,镜下观察左心室心肌组织结构清晰、完整,免疫组化染色效果理想,见图6,为进一步实验及图像分析提供了保证。此外,本方法操作简便实用,灌注量容易掌握,固定效果好。该装置和灌流方法是根据课题组在针灸心血管效应机制研究中的需求而设计的,充分考虑了动物形态学实验中的各种细节问题。它将成为科学研究药物、针灸、针药结合心血管效应机制的一种新型、适用的工具和技术方法。
