左 娟，马美湖*
(华中农业大学 国家蛋品加工技术研发分中心，湖北 武汉 430070)
鸡蛋涂膜保鲜剂中抑菌物质的筛选
左 娟，马美湖*
(华中农业大学 国家蛋品加工技术研发分中心，湖北 武汉 430070)
以大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)为供试菌种，采用滤纸片法和二倍稀释法测定6种植物精油的抑菌效果，6种植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制结果均为：肉桂油＞冬青油＞紫苏叶油＞茶树油＞桉叶油＞连翘油。选定肉桂油、冬青油、紫苏叶油3种植物精油配制复合抑菌物质。复配抑菌物质的配方为：肉桂油0.6mg/mL、冬青油0.4mg/mL、紫苏叶油0.3mg/mL。
鸡蛋保鲜；植物精油；复合抑菌物质；抑菌效果
鸡蛋的腐败变质是微生物、环境因素、和鸡蛋本身的特性相互影响、相互作用的结果[1]，其中微生物是使鸡蛋腐败变质的主要原因。鸡蛋中含有丰富的水分、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素，蛋白pH8.6～6.4，能够满足微生物生命活动的需要，是微生物理想的“天然培养基”[1]。鲜蛋在自然温湿条件下，蛋内各种酶的生物学活性较高，蛋外微生物活跃。鸡蛋是一种高营养的食物，其产量大且具有季节性[2]，鲜蛋产后，若不进行贮存保鲜处理，微生物会通过蛋孔侵入蛋内，在蛋内各种分解酶的作用，使蛋黄膜破裂[3-5]，蛋内部分营养物质被破坏分解，禽蛋的鲜度、卫生状况、营养价值下降[6]。因此如何减少微生物对鸡蛋的污染及危害是鸡蛋保鲜工作中的重要环节。
植物精油是从植物(花、芽、种子、树叶、树皮、草药、木材、水果和根)中提取出来的[7]。近几年许多研究发现，精油成分具有强烈的抑制或杀死微生物的特性[8-10]。本实验采用植物精油作为鸡蛋涂膜保鲜剂中的抑菌剂，因为单一的植物精油的抑菌谱是有限的，所以通过对单一的植物精油的抑菌实验的基础上筛选抑菌效果比较好的3种植物精油进行复配成复合抑菌剂，以增广抑菌谱。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桉叶油、紫苏叶油、肉桂油、茶树油、冬青油、连翘油 江西省吉安振兴香料厂。
大肠杆菌(Escherichia coil)、沙门氏菌(Salmonella)华中农业大学食品科学技术学院微生物实验室。
1.2 仪器与设备
YM 不锈钢立式电热蒸汽消毒器 上海三申医疗器械有限公司；DNP-90 82BS-Ⅲ电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-2D双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 制备方法
1.3.1.1 培养基的制备
葡萄糖-酚红肉汤培养基：每1000mL营养肉汤培养基加入1g酚红，熔化，121℃灭菌30min。
营养琼脂培养基：称取营养琼脂粉约4 5 g，加1000mL水，熔化，121℃灭菌30min。
1.3.1.2 菌悬液的制备
取少量已活化的待测菌于装有9mL无菌水的试管中，充分混合，制成菌悬液，用无菌吸管取1mL 充分混合的菌悬液于试管中，加无菌水9mL，依次制成系列浓度的菌悬液。调至浓度为含孢子或菌体106～107个/mL的菌悬液，备用[11-14]。
1.3.2 实验设计
1.3.2.1 比较单一植物精油抑菌效果的实验设计
采用滤纸片法测定单一植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径；采用二倍稀释法测定单一植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌的最低抑菌质量浓度(MIC)。
1.3.2.2 复合抑菌物质的正交试验设计
单独一种植物精油抗菌谱是有限的，需要把抑菌物质进行复配，从而来提高抗菌谱。从6种植物精油中挑选出3种抑菌效果比较好的植物精油，复配成复合抑菌物质。肉桂油、冬青油、紫苏叶油对大肠杆菌和沙门氏菌的正交试验设计见表1。
1.3.3 测定项目
1.3.3.1 抑菌圈的测定
将直径为6mm的圆滤纸片干热灭菌，然后放入各植物精油中浸泡2h。取待试菌悬液0.3mL于相应的琼脂固体培养基中混合摇匀。待固体培养基凝固以后，用无菌镊子将浸泡过植物精油的圆滤纸片贴在固体平板上，每皿贴3片，同时另取无菌滤纸作对照，每组做3个平皿平行实验[13-15]。然后置37℃培养24h后测定圆滤纸片的抑菌圈直径，结果取3次重复实验的平均值。
1.3.3.2 最低抑菌质量浓度(MIC)的测定
采用液体二倍稀释法测定，取13×10cm灭菌试管8支，按1～8号依次编号。以无菌操作法，于每管中加入无菌葡萄糖-酚红肉汤培养基2mL，然后在第1管中加入质量浓度10mg/mL的植物精油2mL，充分混匀后，吸取2mL加入第2管中混匀，并按此法依次重复进行递增稀释到第6管，第6管混匀后吸出2mL混合液弃去。以上1～6管中分别再加入培养好的稀释菌液0.1mL。第7管中加入0.1mL稀释菌液作阳性对照管，作为细菌对照，第8管中加试物(植物精油)2mL后混匀，吸出2mL混合液弃去，不加菌液作生长对照，作为纯试物对照。每个组合对各种细菌的抑制实验分别做3个平行样[16-18]。将以上各试管置37℃生化培养箱中培养24 h，取出观察结果，以无细菌生长管所含最低试物质量浓度作为MIC。
1.3.3.3 抑菌率的测定
分别取lmL复合抑菌物质与0.lmL细菌悬液混合，充分摇匀。当作用2h时，分别取0.3mL混合液，用混匀法倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平皿。另取lmL无菌水与0.lmL菌液相混合后，也取0.3mL混合液，用混匀法倾注牛肉膏蛋白胨培养基平皿，以作对照[17,19]。以上各皿均置37℃生化培养箱培养24h，观察细菌的生长数，计算抑菌率，见公式(1)。
1.3.3.4 复合抑菌物质的最低杀菌质量浓度(MBC)的测定
从测定1.3.3.2节无细菌生长的各试管中取样，分别划线接种于固体琼脂平板培养基，在37℃的生化培养箱中培养48h后取出观察结果。以固体琼脂平板上菌落生长数少于5个的平板的最低含试物质量浓度作为MBC[17,20-21]。
2 结果与分析
2.1 6种植物精油的抑菌圈直径的测定结果
抑菌圈的判定标准是：抑菌圈直径＞15mm时为最敏感、10～15mm为中度敏感，7～9mm时为低度敏感，无抑菌者为不敏感。6种植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径测定结果如表2所示。
由表2结果可见，肉桂油和冬青油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径均大于15mm，属于高度敏感；紫苏叶油和茶树油对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌圈均处于10～15mm之间，属中度敏感；桉叶油和连翘油对大肠杆菌和沙门氏菌均处于7～9mm，属于低度敏感。表明6种精油对大肠杆菌和沙门式菌均有抑制作用。综合比较来看，对大肠杆菌的抑菌效果为肉桂油＞冬青油＞紫苏叶油＞茶树油＞桉叶油＞连翘油；对沙门氏菌的抑菌效果为肉桂油＞冬青油＞紫苏叶油＞茶树油＞桉叶油＞连翘油。
表 2 6种植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径Table 2 Bacteriostasis diameters of plant extraction oil on several test organisms
2.2 6种植物精油的MIC测定结果
采用二倍逐步稀释法，测定6种植物精油的MIC，结果见表3、4。
表 3 6种植物精油对大肠杆菌的MIC的测定结果Table 3 MICs of six kinds of essential oil to Escherichia coli
表 4 6种植物精油对沙门氏菌的MIC测定结果Table 4 MICs of six kinds of essential oil to Salmonella
由表3、4可以看出，6种植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌均有不同程度的抑制作用。肉桂油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC均为0.3125mg/mL；冬青油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC均为0.3125mg/mL；紫苏叶油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC分别为0.625mg/mL和0.3125mg/mL；茶树油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC均为0.625mg/mL；桉叶油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC均为0.625mg/mL；连翘油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC均为1.25mg/mL。
2.3 复合抑菌物质的正交试验结果
鸡蛋很容易受微生物的感染，尤其容易受大肠杆菌和沙门氏菌的感染，沙门氏菌是致病菌，在鸡蛋中不得检出，所以综合抑菌率中大肠杆菌占40%，沙门氏菌占60%，即：综合抑菌率/%＝大肠杆菌抑菌率/%×0.4＋沙门氏菌抑菌率/%×0.6。
表 5 正交试验结果Table 5 Results of orthogonal experiments
表 6 方差分析表Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments
由表5的正交试验结果可知，肉桂油、冬青油、紫苏叶油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌率影响的主次顺序为：肉桂油＞冬青油＞紫苏叶油。复合抑菌物质的最佳配方应为A3B2C1，即肉桂油0.6mg/mL，冬青油0.4mg/mL，紫苏叶油0.3mg/mL。由表6的方差分析结果可以看出，肉桂油对大肠杆菌和沙门氏菌有显着影响，冬青油和紫苏叶油影响不显着。
2.4 复合抑菌物质的MIC测定结果
根据实验设计，采用二倍稀释法，测定复合抑菌物质的MIC，结果见表7。
表 7 复合抑菌物质的MIC测定结果Table 7 MICs of compound preservative
由表7可知，复合抑菌物质对大肠杆菌的MIC为0.3125mg/mL，对沙门氏菌的MIC也为0.3125mg/mL。细菌对照组变色，纯试物对照组不变色。
2.5 复合抑菌物质的MBC测定结果
从表7中无细菌生长的各组取样，分别划线接种于固体琼脂平板培养基，培养观察，以菌落数少于5个的平板，其取样组质量浓度为MBC，测定结果见表8。
表 8 复合抑菌物质的MBC测定结果Table 8 MBCs of compound preservative
由表8可知，复合抑菌物质对大肠杆菌的MBC为1.25mg/mL，对沙门氏菌的MBC为1.25mg/mL。
3 结 论
从以上实验结果可以看出，植物精油有很强的抑菌效果，作为天然的抑菌物质，植物精油在很多方面都有应用。本实验比较了桉叶油、紫苏叶油、肉桂油、茶树油、冬青油、连翘油的抑菌效果，通过滤纸片法和二倍稀释法分别测定这6种植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈和MIC，结果均显示肉桂油、冬青油、紫苏叶油这3种植物精油的抑菌效果好于另外3种植物精油。因为单一的抑菌物质的抑菌谱是有限的，而鸡蛋中微生物除了大肠杆菌和沙门氏菌以外，还有很多种微生物，所以就需要配制复合的抑菌物质。筛选出对大肠杆菌和沙门氏菌效果比较好的3种植物精油进行复配来增大抑菌剂的抑菌谱，以上实验配制出的复合抑菌物质的配方为：肉桂油0.6mg/mL、冬青油0.4mg/mL、紫苏叶油0.3mg/mL。复合抑菌物质对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC均为0.3125mg/mL，MBC均为1.25mg/mL。
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Screening of Bacteriostatic Materials in Egg-coating Preservative
ZUO Juan，MA Mei-hu*
(National Subsidiary Research Center of Egg Processing, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Spoilage of fresh egg is mainly caused by microorganisms. The screening of egg-coating preservatives was evaluated through antibacterial effect. Escherichia coli and Salmonella were used as test strains to determine bacteriostatic effect on essential oil through filter paper or double dilution methods. Six kinds of plant volatile oil exhibited the inhibition effect on Escherichia coli and Salmonella according to the following order from strong to weak, cinnamon oil, ilex oil, perilla leaf oil, tea tree oil, eucalyptus oil and forsythia oil. Moreover, cinnamon oil, ilex oil and perilla leaf oil have been selected from six kinds of essential oil as the compound bacteriostatic material. The compound bacteriostatic formula was 0.6 mg/mL cinnamon oil, 0.4 mg/mL ilex oil and 0.3 mg/mL perilla leaf oil.
egg preservation；plant volatile oil；compound bacteriostatic material；bacteriostatic effect
TS209
A
1002-6630(2010)09-0019-04
2009-08-01
国家“948”项目(2006-G36)；国家现代农业产业技术体系建设专项
左娟(1984—)，女，硕士研究生，主要从事禽蛋研究。E-mail：zuojuan19840110@126.com
马美湖(1957—)，男，教授，博士，主要从事畜产品研究。E-mail：mameihuhn@yahoo.com.cn
