由继君 赵丹玉
[摘要] 目的 研究槲皮素对软脂酸诱导EA.hy926细胞eNOS合成的影响。 方法 体外培养EA.hy926细胞，分正常对照组、模型组、槲皮素组、二甲双胍组，采用RT-PCR法及免疫组化法，测定各组细胞 eNOS mRNA和蛋白表达。结果模型组细胞eNOS mRNA和蛋白表达显著低于正常对照组（P<0.05），药物组与模型组相比eNOS mRNA及蛋白表达显著增加（P<0.05），药物组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 槲皮素对软脂酸诱导EA.hy926细胞eNOS合成具有显著促进作用。
[关键词] 槲皮素；eNOS；胰岛素抵抗
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2016）12（a）-0001-04
[Abstract] Objective To study the effect of EA.hy926 cells induced by quercetin and eNOS on the synthesis of palmitic acid. Methods EA.hy926 cells were cultured in vitro. Normal control group， model group， quercetin group， metformin group， using RT-PCR method and immunohistochemical method， the expression of mRNA eNOS and protein in each group were determined. Results The cells in the model group of eNOS mRNA and protein expression was significantly lower than that of the normal control group（P < 0.05） and drug treatment group and model group compared eNOS mRNA and protein expression was significantly increased（P < 0.05）， drug group no significant difference（P > 0.05）. Conclusion Quercetin has significant promoting effect on palmitic acid induced EA.hy926 cell eNOS synthesis.
[Key words] Quercetin；eNOS；Insulin resistance
2型糖尿病是由于遗传和环境因素共同作用，互为因果而引起的一种常见的严重影响人类健康的慢性复杂性疾病[1]。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的主要发病机制。相关研究显示，IR的发生，与血管内皮细胞的胰岛素信号转导障碍关系密切[2-3]。其中内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）起重要的调节作用，可促进血管舒张因子一氧化氮（NO）的释放[4]。该实验通过体外高浓度软脂酸诱导人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926细胞），建立IR的血管内皮细胞模型，研究槲皮素对IR状态EA.hy926细胞中eNOS mRNA 和蛋白表达的影响。
1 临床资料
1.1 细胞
人脐静脉血管内皮细胞EA.hy926细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.2 主要药物及试剂
DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、兔抗人eNOS一抗抗体、羊抗兔IgG二抗、PT-PCR试剂盒、槲皮素（MUST-12072505）、 二甲双胍。
2 方法
2.1 细胞培养
用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，传代后生长状态处于对数生长期的细胞，分装到新的培养瓶中继续培养备用。
2.2 制备
配制0.1 mmol/L软脂酸钠溶液 称0.04 g NaOH加入10 mL蒸馏水制成0.1 mmol/L的NaOH溶液，再称取0.025 6 g软脂酸与NaOH溶液混合，70℃水浴。将0.1 mmol/L软脂酸钠溶液溶于5%牛血清白蛋白9∶1混合后，37℃水浴1 h，4℃保存备用。
2.3 实验分组
将体外培养的EA.hy926细胞按5×105/mL密度接种于培养瓶内，随机分为正常对照组、模型组、槲皮素组及二甲双胍组。各组分别加入含10%胎牛血清的DMEM培养基和终浓度为50 nmol/L的胰岛素。除正常对照组外，各组分别加入终浓度为600 μmol/L的软脂酸。根据该实验前期研究结果，槲皮素组加入终浓度25 mg/L的槲皮素，二甲双胍组加入终浓度为2 mmol/L的二甲双胍。
2.4 RT-PCR测定各组细胞eNOS mRNA的表达
各组细胞进行相应处理后，收集细胞，提取总RNA并测定浓度。按RT-PCR反应试剂盒说明进行操作，上游引物序列：5'-GACATTGAGAGCAAAGGGCTG-3'，下游引物序列：5'-CGGCTTGTCACCTCCTGG-3'，扩增片断大小408bp；β-actin上游引物序列：5'-ACACGAAA GCAATGCTATCACCTC-3'，下游引物序列：5'-TGACAG CAGTCGGTTGGAGCGA-3'，扩增片断大小153bp。退火温度为65℃。PCR扩增结束后，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果用凝胶电泳仪进行分析，测各组IOD值，以各组基因条带吸光度与内参β-actin条带吸光度的比值来表示eNOS mRNA表达的强弱。
2.5 免疫组化测各组细胞eNOS的蛋白表达
将细胞接种于24孔板中，各组加药处理后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍。进行10%SDS-PAGE电泳分离，转膜后，PBS洗3遍。在加3%H2O2灭活内源性酶15 min，PBS洗3遍，滴入封闭液，室温20 min后吸出，各组分别加入双抗。DAB显色，倒置显微镜下观察拍照。采用医学图像分析系统测定平均光密度值每组测6个不同视野取均值作为该组测定值。
2.6 统计方法
采用SPSS 17.0统计学软件分析数据，进行单因素方差分析，两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1 各组EA.hy926细胞eNOS mRNA的表达
RT-PCR结果，与正常组相比，模型组细胞eNOS mRNA表达显著减少。槲皮素组、二甲双胍组与模型组相比eNOS mRNA 表达显著增加。药物组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图1、图2及表1。
3.2 免疫组化实验结果
正常对照组可见大量的eNOS 阳性表达细胞，与正常对照组相比，模型组细胞eNOS 蛋白阳性表达显著减少，药物组可见大量eNOS 阳性表达细胞，与模型组相比表达显著增加。见图3及表2。
4 讨论
血管内皮细胞表面的胰岛素受体与血液中的胰岛素结合后，将胰岛素受体底物2（IRS2）磷酸化，IRS2进一步激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），后者激活下游蛋白激酶B（PKB，也称作Akt）等，Akt能激活eNOS，使其磷酸化从而发挥生物学效应，活化的eNOS能催化合成NO[5]。IRS2/eNOS信号途径的激活增加了NO的合成，提高了毛细血管的通透性，促进胰岛素从血液进入组织，产生生物学效应，达到降低血糖的作用。NO是心血管内重要的舒张调节因子，起着调节血管舒张功能，保护血管的作用。可抑制血小板聚集，脂质过氧化等[6]。NO由一氧化氮合酶催化产生，相关研究显示eNOS合成异常时，NO合成减少，血管内皮细胞出现功能障碍，使靶细胞对胰岛素的摄取、利用降低， 从而引起IR发生[7]。该实验通过体外培养EA.hy 926细胞，加入高浓度软脂酸在培养基中，以建立高脂状态下IR的血管内皮细胞模型，并用槲皮素进行干预，研究在IR状态下血管内皮细胞内eNOS信号通路的变化，试阐明2型糖尿病的部分机制，以及槲皮素的作用机制，为胰岛素抵抗的治疗寻求新的靶点。
随着双胍类、磺酰脲类、α-糖苷酶抑制剂等治疗药物的广泛应用，糖尿病的药物治疗取得了迅速发展，但许多方案仍不理想，不能有效稳定的控制糖尿病慢性并发症的发生[8]，中医中药的研发利用已成为当代医家学者面临的重要课题。槲皮素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，其广泛存在于自然界，相关报道显示槲皮素具有抗氧化，抗血小板聚集，抗抑郁、调节血糖的作用[9]。槲皮素通过抗炎、抗氧化的功能可减轻血管内皮细胞功能障碍，有效改善IR，以达到预防和限制糖尿病及其并发症发生及发展。该实验研究结果表明，与正常对照组比，模型组细胞的eNOS mRNA及蛋白表达均显著下降，说明在高浓度软脂酸诱导作用下，血管内皮细胞eNOS的表达受到抑制，可以减少血管内皮细胞NO的释放，降低NO的生物学效应，使胰岛素通过血管内皮屏障与靶细胞作用受阻，影响血管的通透性，与以往研究结果一致[10]。槲皮素组与二甲双胍组细胞的eNOS mRNA 及蛋白表达均显著提高，说明槲皮素与二甲双胍能增强IR状态下血管内皮细胞eNOS mRNA 及蛋白表达，提高了血管内皮细胞NO生成，从而改善血管内皮细胞通透性，促进胰岛素发挥其生物学效应。槲皮素与二甲双胍的作用差异无统计学意义，但槲皮素不良反应小，药理作用广泛，对糖尿病并发症疗效显著，具有广泛的开发前景。该实验进一步从分子生物学水平研究槲皮素改善IR的机制，观察了槲皮素对EA.hy926细胞的保护作用，为中医中药开发研制治疗IR的临床用药奠定一定的实验基础。
[参考文献]
[1] 汪会琴，胡如英，武海滨，等.2型糖尿病报告发病率研究进展[J].浙江预防医学，2016，28（1）：37-39，57.
[2] 刘恋，李刚，柳春，等.苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导EA.hy926细胞IRS2合成影响[J].中国实验方剂学杂志，2014， 20（8）：182-185.
[3] 赵丹玉，李刚，王艳杰，等.苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导EA.hy926细胞PI3K合成影响[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（3）：169-171.
[4] 王玉明，段勇，刘华，等.2型糖尿病血管并发症患者eNOS基因第4内含子多态性的初步研究[J].临床检验杂志，2004，22（4）：268-269.
[5] 唐坤裕，朱榆红.PI3K/Akt-eNOS-NO信号通路与脑缺血后适应的研究进展[J].国际神经病学神经外科学杂志，2013，40（1）：67-70.
[6] Tousoulis D，Kampoli AM，Tentolouris C，et al.The role of nitric oxide on endothelial function[J].Curr Vasc Pharmacol，2012，10（1）：4-18.
[7] 于洋，赵丹玉，王艳杰，等.软脂酸对EA.hy926细胞一氧化氮合成的影响及六味地黄丸的干预效应[J].中国老年学杂志，2014，34（3）：1583-1585.
[8] 王丽，赵振宇.口服降糖药对2型糖尿病患者心血管安全性的应用评价[J].中国医院药学杂志，2016，36（11）：1-5.
[9] 王艳芳，王新华，朱宇同.槲皮素药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2003，15（2）：171-173.
[10] 杨雪峰，赵丹玉，柳春，等.苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导EA.hy926细胞NO合成的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2012，28（10）：1055-1057.
（收稿日期：2016-09-15）
