PI3K—Akt—eNOS信号通路在间歇性低氧减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用

王媛媛　　曹建　　万建华

[摘要] 目的 探讨间隙性低氧环境下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶信号通路（PI3K-Akt-eNOS）在大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制。 方法 64只大鼠随机分为4组，假手术组（n=16）、缺血/再灌注组（n=16）、缺血/再灌注组-间歇性低氧组（n=16）、间歇性低氧-缺血/再灌注-磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂组（n=16）。采用球囊结扎冠状动脉方法制作心肌缺血再灌注动物模型，将老鼠暴露在低氧循环制作间隙性低氧动物模型，实验处理结束后，通过TUNEL 法检测心肌细胞凋亡指数，Western-Blot方法检测磷酸化AKT蛋白（p-Akt）、磷酸化eNOS（p-eNOS）蛋白表达。 结果 与缺血/再灌注组比较，间歇性低氧+缺血/再灌注组心肌细胞凋亡指数为（21.73±4.56）%，心肌细胞凋亡指数减少，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白分别为（1.228±0.269）、（1.427±0.375），表达均升高，各组差异均有统计学意义（P<0.05）；与间歇性低氧+缺血/再灌注组比较，间歇性低氧-缺血/再灌注组大鼠+磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂组大鼠心肌为（30.84±3.65），凋亡指数升高，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白分别为（0.624±0.146）、（0.842±0.246），表达均降低，各组差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 在间歇性低氧状态下，PI3K-Akt-eNOS信号通路可以减少心肌细胞凋亡，在心肌缺血/再灌注损伤中具有保护机制。

[关键词] 磷酯酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶；间歇性低氧；心肌缺血/再灌注

[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）27-0035-03

Effect of PI3K-Akt-eNOS signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 WAN Jianhua3

1.Department of Cardiology， Nanchang Third Hospital， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， Nanchang University Second Affiliated Hospital， Nanchang 330001， China； 3.Department of Anesthesiology， Jingdezhen Hospital of TCM in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS） signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats. Methods 64 rats were randomly divided into 4 groups： sham operation group（n=16）， ischemia-reperfusion group（n=16）， ischemia-reperfusion-intermittent hypoxia group（n=16）， intermittent hypoxia-ischemia-reperfusion-phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group（n=16）. The animal model of myocardial ischemia and reperfusion was established by balloon ligation of coronary artery. The rats were exposed to hypoxic circulation to produce intermittent hypoxic animal models. After the end of the experiment， the apoptotic index of myocardial cells was detected by TUNEL method， and the expression of phosphorylated Akt protein （p-Akt） and phosphorylated eNOS （p-eNOS） protein was detected by Western-Blot method. Results Compared with ischemia-reperfusion group， the apoptotic index of myocardial cells was（21.73±4.56）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group. The myocardial cell apoptosis index was decreased， and phosphorylated Akt protein and phosphorylated eNOS protein were（1.228±0.269）， （1.427±0.375） respectively. The expressions were all increased， and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）； compared with intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group， the myocardium of rats was（30.84±3.65）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group+phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group. The apoptosis index was increased， and the phosphorylated AKt protein and phosphorylated eNOS protein were（0.624±0.146）， （0.842±0.246） respectively. The expressions were all decreased and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Under the status of intermittent hypoxia， PI3K-Akt-eNOS signaling pathway can reduce myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing the apoptosis of myocardial cells.

[Key words] Phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS）； Intermittent hypoxia； Myocardial ischemia-reperfusion

缺血的心肌再灌注时会起一系列心脏及其血管的恶性事件，例如严重的再灌注心律失常、组织水平无复流及心肌舒缩功能障碍等不良事件。对急性心肌梗死预后有直接影响的就是心肌缺血/再灌注损伤。缺血/再灌注损伤发生可能与炎性反应、细胞凋亡、氧反常、钙反常、pH 反常等原因有密切关系[1-3]，寻求再灌注治疗时保护心肌的新靶点至关重要。目前研究表明，间歇性低氧对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用，可以通过增加心脏对缺血、缺氧的耐受性来达到心脏保护的目的，在抗心肌缺血/再灌注损伤中发挥重要作用。本实验拟讨论在间歇性低氧状态下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信号通路在大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

本实验已通过南昌大学医学院动物伦理委员会审查，许可证号[SCXK（赣）2009-0001]。选取8～10周健康清洁级SD大鼠64只，雌雄各半，体重（200±20）g，由南昌大学动物实验中心提供。磷酯酰肌醇-3激酶抑制剂（Wortmannin）渥曼青霉素购自天津药业焦作有限公司，Tunel 凋亡试剂检测盒购自德国Roche公司；小鼠p-eNOSp-Akt单克隆抗体、p-Akt抗体购自美国Santa Cruz公司；蛋白浓度测定标准品购自普利莱公司；兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Sigma公司。

1.2 实验分组及模型建立

64只实验动物随机分为4组，制作大鼠缺血/再灌注损伤模型，实验前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，通过气管插管、人工呼吸，然后开胸结扎冠脉左前降支，收紧结扎线，30 min 后轻拉松结线，扩开血管，缝合[4]。通过低氧循环制作大鼠间歇性低氧模型：每日4次在低氧氧舱分别接受减压低氧处理，每次接受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再行氧和处理，循环5次，在低氧氧舱进行间歇性低氧处理14 d，对照组选取含氧量正常的老鼠。假手术组（n=16），选取尾静脉注射生理盐水，丝线穿过冠状动脉左室支，不结扎；缺血/再灌注组（对照组，I/R）（n=16），制作大鼠缺血/再灌注模型。间歇性低氧+缺血/再灌注组（n=16，IH+I/R）：建立间歇性低氧动物模型后，制作缺血/再灌注损伤模型；间歇性低氧+缺血/再灌注+PI3K抑制剂组（n=16，IH+I/R+PI3K抑制剂），建立间歇性低氧模型，制作缺血/再灌注模型时，在冠状动脉左前降支闭塞15 min前注射磷脂酰肌醇酯3激酶抑制剂（渥曼青霉素）（24 μg/kg，ip）。

1.3 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡

依据试剂盒说明书操作，检测各实验组心肌细胞凋亡指数。使用标记液做阴性对照，阳性对照选取脱氧核糖核酸酶处理切片。随机在每张切片上选取10 个视野，计数凋亡细胞个数。心肌细胞凋亡指数=凋亡细胞个数/所有细胞个数的百分比。

1.4 通过Western blot法检测p-eNOS、p-Akt蛋白表达

动物模型制备结束后，处死存活大鼠。选取各组缺血区左心室全层心肌组织约20 mg，添加蛋白裂解液，随后按步骤匀浆、裂解、提取总蛋白。各组提取蛋白样品，先通过SDS-PAGE电泳转膜，室温下5%封闭2 h，再与稀释的Actin抗体、p-Akt、p-eNOS在4℃孵育过夜（稀释比例为1∶1000）。洗膜后孵育2 h（稀释比例为1∶3000）；再次洗膜，通过电化学发光显色曝光、拍照。以Actin作为内对照，通过BIORAD 软件分析蛋白条带。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组心肌细胞凋亡指数

TUNEL 试剂盒检测心肌细胞凋亡指数，与假手术组比较，缺血/再灌注组可见较多TUNEL阳性凋亡细胞，凋亡指数明显升高（38.46±0.82）%；间歇性低氧处理后，心肌凋亡细胞明显减少、心肌细胞凋亡指数下降（21.73±4.56）%；间歇性低氧+缺血/再灌注组+ PI3K抑制剂（渥曼青霉素）组处理后，凋亡指数增加（29.84±3.65）%，各实验组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1及表2。

2.2心肌组织p-Akt、p-eNOS蛋白水平表达

Western blot 法检测各实验组Akt、p-eNOS蛋白表达，与假手术组比较，p-Akt、p-eNOS表达升高（P<0.05）；与IH+I/R组比较，IH+I/R+PI3K抑制剂组p-Akt、p-eNOS蛋白表达下降（P<0.05）。见表1、表2及封三图4。

3 讨论

目前缺血性心脏病的发病率位于原发性心脏病之首，其中心肌缺血再灌注损伤约占50%，是冠状动脉内溶栓、冠脉搭桥以及介入治疗中常见的严重并发症[4-6]，如何减少心肌缺血/再灌注损伤已成为心肌保护的研究建立热点之一。低氧是心肌缺血的主要因素，基础和临床医学研究所关注的热点是如何通过增加心脏对低/缺氧及对缺血耐受性而达到保护心脏的目的。研究认为通过长期（如慢性低氧适应）或短期缺血预适应可以对心脏缺血出现保护作用[7]。但是对于相关信号通路、受体途径以及信号转导等深层次的作用机制研究较少。

苏氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸（PI3K-Akt）可以抑制细胞凋亡，参与细胞增殖分化，是细胞生存的一种重要信号通路之一，在心肌缺血再灌注损伤机制中发挥重要作用。PI3K活化底物PI-3，4，5- P3（PIP3）与Akt结合，Akt被磷酸化而激活生成P-Akt，磷酸化的Akt具有抗凋亡、促细胞生存及促蛋白合成及等活性[8-10]。eNOS是合成NO的限速酶，含1203个氨基酸，其分子量为133 kDa，是由位于人类 7号染色体7q35～7q36的NOS3基因编码的蛋白，是p-Akt下游的重要底物之一，可激活蛋白激酶及线粒体ATP敏感性钾离子通道，通过抑制线粒体通透性转换孔的开放，降低线粒体膜通透性。还通过抑制钙超载，同时抑制线粒体释放下游Caspase-9等凋亡因子的表达，改善线粒体功能，并促进Bcl-2等抗凋亡因子的表达，减少细胞凋亡[11-13]。同时eNOS是Akt下游的重要底物之一，有研究者认为Akt磷酸化位点激活，是一氧化氮的重要来源，一氧化氮在血管舒张、血管重构及生成及创伤愈合等方面发挥作用。在缺氧情况下，NO可通过磷脂酰肌醇3激酶或丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK） 信号通路诱导HIF-1产生，促进新生血管，干扰代谢性适应反应以重新适应缺血的生理环境[14]。还发现eNOS源性的一氧化氮可以减轻血小板和白细胞和血小板在细胞壁的粘附，减少细胞凋亡[15]。eNOS的高表达可参与血流的调节，减少炎性细胞的浸润及抑制血管痉挛、防止细胞内钙超载等再灌注损伤。

本实验建立了缺血/再灌注损伤及间歇性低氧模型，实验发现通过间歇性低氧预处理，PI3K-Akt信号途径激活，心肌细胞凋亡降低，p-Akt及eNOS蛋白表达增加。在使用PI3K抑制剂后，心肌细胞凋亡指数增加，-Akt及eNOS蛋白表达降低。实验结果提示间歇性低氧处理后，激活PI3K-Akt信号途径被激活，p-AKt表达增加，与此同时下游底物eNOS蛋白表达增加，减轻心肌细胞凋亡，这一效应可被PI3K特异性抑制剂渥曼青霉素拮抗，提示在间歇性低氧状态下，通过激活PI3K/Akt信号通路，激活P-Akt及活化内皮型一氧化氮合酶，这些下游底物可能通过提高抗凋亡蛋白表达，抑制促凋亡蛋白等机制降低心肌细胞凋亡率，从而在缺血/再灌注损伤中起到保护作用。

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（收稿日期：2017-06-15）