褪黑素和TGF-β信号通路与滋补肝肾中药治疗PD分子机制的关联性*

宋芳 张倩 孙小慧 毕研艳 张念平 焉兆利

帕金森病（Parkinson disease，PD）是常见的神经退行性疾病，其病理改变为中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元丧失、神经元胞浆内含有α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）的路易小体形成。临床表现为静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓、姿势步态异常等运动障碍症状，以及认知和行为障碍、自主神经功能紊乱和睡眠障碍等非运动障碍症状[1]。

药物是目前治疗PD 的主要手段，这些药物大多数为DA 能药物（如左旋多巴，L-DOPA），它们可通过增加纹状体内DA 水平起到治疗作用。这些药物早期可以很好地控制症状，但随着时间的推移，由于非生理性DA 浓度波动、脱靶效应，这些药物逐渐失去疗效并产生很多副作用[2]。中药具有多途径、多靶点的作用机制，治疗PD 有独特优势。临床上主要是通过辨证论治，应用不同类型的中药方剂治疗PD。尽管中医界对PD 的病机和证型尚存争论，但众多医家认为肝肾阴虚是PD 的病理基础和核心病机，又是PD 的主要证型[3]。根据此证型使用不同的滋补肝肾中药（如补肾养肝熄风方、左归丸加减、熄风定颤丸等）治疗PD，均取得了良好的临床效果[4-7]。但滋补肝肾中药治疗PD 的分子机制仍不完全清楚，进行这方面研究具有重要意义，可以为药物研发、辨证论治提供依据。

1 滋补肝肾中药治疗PD的理论依据

中医认为PD 属颤病、颤振、震颤等范畴，又称振掉、内风，《素问·五常政大论》曰：“掉眩巅疾”“其病动摇”“掉振鼓栗”[8]。多数医家认为颤病病位在脑，主要与肝、肾等脏腑功能失调有关，如《素问·至真要大论》云：“诸风掉眩，皆属于肝”，《赤水玄珠·颤振门》注：“颤振者，非寒噤鼓慄，乃木火上盛，肾阴不充”[9]。颤病主要发生于老年人，年老肝肾自亏，肾水不能滋养肝木，木燥而生风致颤。此外，肾主藏精，精生髓，脑为髓之海，故肾精不足，可致髓海失充，神机失用，肢体失控，出现肢体震颤、拘挛。现代医学证实肝肾阴虚是PD 的基础，是其发病的根本病机，肝肾阴虚贯穿于PD 患者的整个疾病过程[6]。故在PD 治疗上应当注重填精益髓，滋肝补肾，应用滋补肝肾中药可以缓解患者的临床症状。

2 肝阴、肾阴可能与褪黑素（melatonin，MLT）和TGF-β通路存在联系

MLT 是松果体在夜间分泌的一种神经激素，易通过血脑屏障，有抗氧化、抗炎症反应、神经保护、抑制生殖系统发育、延缓衰老、调节骨骼生长、调节昼夜节律等作用[10-11]。王剑等[12]提出MLT 的生理功能与肾阴功能相似：MLT 分泌量昼少夜多，冬季高于夏季，与中医“夜主阴，昼主阳”“肾主冬”理论相符；随年龄增长MLT 分泌下降，与中医理论“人至四十而阴气自半”相符；MLT 对神经系统有镇静作用，符合中医理论“阴主静”的阐释；青春期前MLT 抑制性腺发育，可解释中医肾主生殖，肾阴对肾阳温煦、激发、兴奋的功能有抑制作用；MLT是强效抗氧化剂，有亲脂和亲水的特点，易进入任何细胞保护亚细胞成分免被自由基氧化损伤，这对应中医理论肾阴滋养全身的作用。TGF-β 信号通路在细胞的生长、增殖、迁移、分化、存活和凋亡等方面发挥重要作用[13]。研究表明，TGF-β 信号通路也与肾阴关系密切。补肾中药可能通过激活TGF-β 信号通路并上调关键效应因子Smad3 及转录因子GATA-4 的表达，进而改善肾阴虚状态[14]。肾阴与肝阴密切相关：中医认为“肝肾同源、精血同源”。肾为五脏之本，肾藏精，肝藏血，肾为肝之母，母子相生，精血同源，肝阴和肾阴相互滋养。虽然肝和肾的结构和功能有所差异，但起源相同，故生理病理相关，治疗疾病时可采用“肝肾同治”的方法。故MLT、TGF-β 信号通路可能与肝阴、肾阴有着密切关系。

3 MLT保护DA能神经元的作用机制

氧化应激是PD 重要的发病机制之一。MLT 的抗氧化能力远远强于维生素C 和E，它能直接去除活性氧（reactive oxygen species，ROS），抑制促氧化酶，促进超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化酶的基因表达，减少细胞氧化损伤[15]。MLT 可以不依赖受体，以其自身化学结构的特点发挥直接抗氧化作用：MLT 可以向自由基提供一个或多个电子，从而中和其氧化活性，MLT 还能与其他抗氧化分子如抗坏血酸协同来发挥抗氧化作用[16]。MLT 还可通过其代谢产物间接发挥抗氧化作用，促进神经细胞生存。N1-乙酰基-N2-甲酰基-5-甲氧基犬尿胺（N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine，AFMK）和N1-乙酰基-5-甲氧基犬尿胺（N1-acetyl-5-methoxykynuramine，AMK）都是MLT 的代谢产物，并且都存在于脑内。AFMK 和AMK 均被认为是有效的抗氧化剂，具有清除自由基和激活自由基清除级联反应的能力[11]。自噬-溶酶体系统、分子伴侣介导的自噬、泛素-蛋白酶体系统等蛋白清除途径受损可导致神经毒性α-syn 寡聚体的积累和扩散，毒性α-syn 通过聚集、纤维化，最后产生路易小体，介导DA 神经元的变性死亡。MLT 被证实能抑制α-syn 聚集，它通过抑制α-syn 原纤维形成和二级结构转变来阻止α-syn 形成，并降低其诱导的细胞毒性，防止神经细胞变性[17]。炎症反应在神经退行性疾病的发生和进展中也起重要作用。最新证据表明MLT 作为细胞保护分子能减缓炎症衰老的过程。MLT 及其犬尿胺代谢产物可以预防兴奋性毒性，减少自由基负荷并减少促炎症细胞因子的产生。MLT 也能与金属结合，通过形成螯合物来减少羟基自由基的损伤，从而减轻金属毒性。MLT 还有抗亚硝化作用，还可以通过阻止蛋白质复合物与DNA结合以抑制核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）途径的激活发挥神经保护作用[18]。MLT有助于改善PD 的非运动症状，如记忆障碍、抑郁、焦虑和睡眠障碍等。多达65%的患者在出现快速眼动睡眠行为障碍（rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD）后的10～13 年发展为PD，而每天服用MLT 可有效治疗RBD。通过淋巴系统清除有害代谢物利于恢复脑功能，而睡眠不足与淋巴清除率降低存在密切关系。PD 患者可能存在RBD，给予MLT 后既能保证睡眠又能提高淋巴清除率。另外，在PD 动物模型中，MLT 能恢复纹状体的密度，而治疗PD 最常用的药物L-DOPA 却没有这一疗效，这提示MLT 可以作为治疗PD 的辅助用药[17]。大多数研究认为MLT 通过阻止DA 能神经元凋亡而改善PD 的运动症状，但也有研究认为MLT 没有为PD的运动症状带来益处。虽然存在这些分歧，但MLT能预防DA 能神经元神经变性的观点已被普遍接受[17]。另外，Bolitho 等[19]报道使用DA 能药物治疗PD 后，MLT 的分泌显着增加，提示MLT 与PD可能有潜在的联系。文献报道的MLT 保护DA 能神经元的作用机制见图1。

图1 与PD相关的MLT作用机制

4 TGF-β信号通路对DA能神经元发育和存活的影响

TGF-βs（包括TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3）是具有多种生物活性的多肽生长因子，广泛分布于各种类型的组织中，调节许多细胞活动进程，例如细胞增殖和分化、转移、新血管形成和免疫抑制[10]。TGF-β 信号通路对DA 神经元发育和存活至关重要。用TGF-βs 处理中脑腹侧前体细胞，可增加DA 能神经元数量，而降低内源性TGF-βs 则能抑制中脑DA 能神经元形成[20]。如果将TGF-β2和TGF-β3 同时敲除，可导致胚胎期小鼠的DA 能神经元凋亡[21]。以转基因手段降低TGF-β 信号传导，小鼠黑质纹状体系统可出现退化，表现出运动障碍症状。而在黑质中增强TGF-β 信号传导则可显着减少1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的DA 能神经变性和运动障碍。这表明TGF-β 信号传导障碍会增加发生PD 的风险，而激活该通路具有治疗PD 的潜力[22]。TGF-β 通路中Smad3 的表达缺失可导致纹状体内DA 代谢加剧，使DA 能神经元逐步丧失，并出现α-syn 聚集[22-23]。研究表明α-syn 对神经元突触有毒性作用，而TGF-β1 可保护中脑神经元免受这种毒害作用，防止突触丧失[23]。TGF-β1 在黑质DA 能神经元中大量表达，呈剂量依赖性地促进DA 能神经元轴突生长[21]。另外，α-syn 原纤维片段可激活小胶质细胞，进而激活A1 型星形胶质细胞，后者产生大量炎症物质，损害突触形成并诱导神经元死亡。TGF-β1 作为神经系统的重要抗炎因子，可抑制小胶质细胞的活化并阻止A1 星形细胞产生，从而防止DA 能神经元凋亡[23]。小胶质细胞活化后产生大量炎症介质如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1β，和氧化应激分子如诱导型一氧化氮合酶iNOS、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（PHOX），这些物质引发并加重PD[24]。TGF-β1 能调节小胶质细胞的活性，减少炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6 及NO 的产生，降低神经毒性[25]。小胶质细胞通过PHOX 的活化产生ROS，细胞内ROS 的增加可激活NF-κB 途径，导致大量炎症介质产生，TGF-β1 可以通过抑制PHOX 来下调NF-κB 的活性[26]。TGF-β 通路还可能通过以下机制发挥神经保护作用：TGF-β1 通过激活ERK/MAPK 信号途径促进其磷酸化，使Bcl-2 家族中的Bad 促凋亡蛋白失活；增强TGF-β1 信号转导能上调Bcl-2 家族中抗凋亡蛋白的表达，发挥抗凋亡作用；TGF-β1 还与神经营养因子有协同作用，是FGF-2 和GDNF 等营养因子发挥作用所必需的辅因子[27]。GDNF 受体GFR-α1 募集到细胞膜上需要TGF-βs 的参与，降低TGF-βs 则能消除GDNF 对DA 能神经元的保护作用[20]。TGF-β 信号通路影响DA 能神经元发育和存活的相关机制，见图2。

图2 TGF-β信号通路影响DA能神经元发育和存活的相关机制

5 MLT与TGF-β信号通路之间的相互作用

MLT 和TGF-β 信号通路之间有密切的联系。研究表明，MLT 对TGF-β 通路有正调控作用：不管在体内还是体外实验中，MLT 均能上调胃癌肿瘤 组 织 中TGF-β1 的 表 达[10]。Proietti 等[28]等 发现使用MLT 干预MCF-7 人乳腺癌细胞后，癌细胞中TGF-β1 的表达量明显上调，且能被TGF-β1中和抗体完全抑制。MLT 还能以浓度依赖的方式显着减少骨髓间充质干细胞凋亡，同时增加营养因子TGF-β1 的表达，并降低具有激活凋亡功能的Bcl-2 相 关X 蛋 白（Bcl-2-associated X protein，Bax）的表达[29]。一定量的TGF-β 对维持正常的软骨基质成分至关重要，MLT 可能通过上调TGF-β来达到刺激软骨细胞产生软骨基质成分的作用[30]。MLT 还可以通过上调TGF-β1 和Ⅱ型胶原蛋白对肿瘤坏死因子TNF-α 介导的软骨细胞损伤起到保护作用[31]。但也有研究指出MLT 对TGF-β 通路有负调控作用：MLT 通过抑制TGF-β1 的表达和Smad3 的磷酸化抑制肺组织纤维化[32]；MLT 通过抑制TGF-β1/Smad 通路来改善大鼠肝脏纤维化[33]。以上结果表明在不同细胞中MLT 对TGF-β 通路的调控作用不同。在DA 能神经元中MLT 对TGF-β通路有何调控作用尚未见报道。

6 中药对MLT和TGF-β信号通路的调控作用

滋补肝肾中药影响MLT 和TGF-β 信号通路的报道较少见，但有文献[34-35]指出其他中药可影响MLT 的表达、调控TGF-β 信号通路：温肾类中药金匮肾气丸、蛇床子活性组分可以增加大鼠血清中MLT 的含量；阴虚可引起体内MLT 水平下降，而滋阴中药熟地黄可以提高阴虚模型大鼠血清MLT的水平[36]。养血调肝、健脾利湿中药当归芍药散可促进老年大鼠松果体分泌MLT，具有清除自由基、神经保护的作用[35]。安神补气利湿中药开心散可促进神经生长、抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡，能增加血浆MLT 及褪黑素受体MT1 的表达[37]。芪连扶正胶囊的含药血清可以上调TGF-β 通路的Ⅰ型受体和Ⅱ型受体，及Smad2、Smad3、Smad4 的表达，下调TGF-β1 和Smad7 的表达，影响TGF-β/Smad通路。姜黄素可减少TGF-β1 表达，下调Smad3 表达，上调Smad7 表达。姜黄素还可抑制TGF-β 诱导的Smad2、Smad3 磷酸化及转录水平[38]。补骨脂素可以激活BMP/Smads 信号通路，促进Smad1/5/8的磷酸化及BMP-2 及BMP-4 的蛋白表达[39]。滋补肝肾中药是否能影响MLT 表达、调控TGF-β 信号通路传导这一问题值得深入研究。

临床上滋补肝肾中药治疗PD 取得了良好的效果，通过综述文献，滋补肝肾中药治疗PD 的机制可能与MLT 和TGF-β 信号通路密切相关。MLT 和TGF-β 激活后引起的抗氧化、抗α-syn 聚集、抗炎症等信号级联反应可能是滋补肝肾中药治疗PD的关键所在。在DA 能神经元中，MLT 与TGF-β信号通路还可能存在调控作用。探讨滋补肝肾中药和MLT、TGF-β 信号通路的关系，一方面可以揭示滋补肝肾中药引起的相关因子表达变化，解释其作用机制，另一方面也可以阐明肝肾阴虚证型的分子基础。